Буфер самодельный: Самодельные сабвуферы | 2 Схемы

Содержание

Самодельные сабвуферы | 2 Схемы

Сборник чертежей корпусов и схем УМЗЧ самодельных сабвуферов под динамики 12, 15, 18 дюймов. Всё для самостоятельной сборки саба.

Вот ещё один самодельный активный сабвуфер, который сделан сразу в двух экземплярах (для разных комнат). Они отличаются практически только цветом передней панели (один имеет светлый …

Всем аудиорадиолюбителям салют! Хочу представить свою конструкцию самодельной низкочастотной колонки под басс гитару 2x 10″, созданную для домашних нужд (для репетиции). Предполагалось, что это будет …

Решил как-то сделать сабвуфер небольшой мощности, на 100 Вт. Не столько для мощного баса, сколько для отыгрывания низких частот, с которыми справляются далеко не все …

Как и все фанаты качественного и мощного звука, решил добавить немного баса в свою тачку. Изначально стояло оборудование BOSE, оно играло великолепно, но не слишком …

Представляем самодельный активный автомобильный сабвуфер на популярном динамике GDN 20/80/2, его параметры 2 Ом 20 см 80 Вт.

Под него идёт ящик из МДФ вместимостью …

Прочитав аудиораздел на сайте 2 Схемы, решил тоже сделать такой автомобильный сабвуфер. Так как раньше в багажнике моего старенького Форда стояла колонка на 150 Вт …

Привет всем читателям «двух схем», хочу представить новую конструкцию, которая была собрана около 2х лет назад. Сабвуфер основан на усилителе Холтон 400, известном всем аудиофилам, …

Как-то так получилось, что в последнее время отошел от классических решений и звука, предлагаемого типичными магазинными наборами. После бесчисленных прослушиваний и сборки корпусов различной конструкции …

Для обычной фоновой прослушки музыки или звуков ПК хватает 2-х небольших настольных колонок, но для фильмов или игр хочется басов по-мощнее. Тогда и родилась идея …

Вот довольно несложная конструкция сабвуфера, который за свой относительно плоский размер можно даже назвать компактным (как для 300 Вт мощности).

Материалы тут дешевые, столярки минимум, …

Привет всем, хотим представить ещё одну конструкцию самодельной акустической системы из двух динамиков ГДН 13/40/2 15 Ом и одного ВЧ 10/80/7 8 Ом. Кроссовер там …

Сейчас мы покажем как создать действительно хорошие сценические колонки с высокой мощностью и эффективностью за относительно небольшие деньги в домашних условиях. Часто бывают ситуации, когда …

Всем любителям собирать самому, а не покупать готовое, пламенный привет! Иногда играю на дискотеках и захотелось добавить в набор колонок довольно сильный и мобильный сабвуфер. …

Всем аудиолюбителям привет! Наконец добрался до сборки такой простой конструкции, как сабвуфер, и решил поделиться итогом работы с читателями сайта 2 Схемы. Предполагалось, что это …

Всем радиоэлектронщикам и аудиофилам привет! Возникла идея собрать небольшой сабвуфер для дома, который не занимает кучу места как тумбочка, а сможет очень красиво спрятаться. Предполагалось, …

Что такое простейший сабвуфер? Просто НЧ динамик в корпусе, подключенный к выходу УМЗЧ. А нормальный? Это уже фильтр НЧ на входе с регулировкой фазы. Но …

Представляем всем гостям сайта 2Схемы ещё один интересный проект, на этот раз пассивный сабвуфер на динамике STX 15 дюймов. Параметры динамика саба Вот его характеристики: …

Построить корпус к сабвуферу не проблема, проблема как управлять тем НЧ динамиком? Вначале творческих изысканий сделал усилитель на основе попсовых интегральных микросхем TDA7294, LM3886, LM4780. …

Всем пряморуким любителям хорошего звука посвящается… Разрешите представить ещё один недавно созданный проект отличного НЧ динамика. Проект был создан в свободное от работы время — …

Представляем ещё один самодельный усилителя на знаменитой микросхеме TDA7294. Это усилитель по системе 2.1. Канал сабвуфера — это TDA7294 в мостовом включении, а на стереоканалы …

Как сделать сабвуфер своими руками

Делаем самодельный автомобильный сабвуфер

Интересных способов того, как сделать сабвуфер своими руками, довольно много. И порой самодельный сабвуфер даже получается намного лучше, чем купленный, если, конечно, делать всё правильно.

Сабвуфер — это устройство для воспроизведения низких частот

Из чего можно сделать сабвуфер?

Нечто, подобное сабвуферу, можно соорудить из нескольких кусков фанеры и старых динамиков. Да и вообще, что касается колонки сабвуфера, то её можно и купить, например, на радиорынке.

Наслаждаться чётким и хорошим аудиозвуком в автомобиле можно и посредством использования сабвуфера неактивного плана. К тому же самостоятельно изготовить его не составит особых трудов. Он не потребует установки усилителя, и работа сведётся только к проектировке и сборке. Что касается монтажа такого сабвуфера, то его можно установить прямо внутрь короба.

Видео о том, как начертить корпус сабвуфера:

Начинаем изготовление

Первое, что нужно сделать, это вооружиться необходимыми материалами и инструментами.

Для изготовления сабвуфера домашнего производства нам понадобятся:

  • динамик;
  • решётка защитная;
  • хороший клей, лучше эпоксидный;
  • розетка, через которую будет осуществляться подключение;
  • стеклоткань;
  • провод, 3 мм;
  • кисть;
  • фанера;
  • ДСП, 16 мм;
  • гайки и саморезы, обязательно по дереву;
  • болты;
  • малярный скотч;
  • полиэтилен;
  • универсальная шпаклёвка.

И конечно же, инструменты — куда уж без них:

  • лобзик по дереву;
  • шуруповёрт или дрель.

Начинаем. Сначала требуется подобрать хороший динамик. Не стоит и говорить о том, что чем мощнее он будет, тем громче будет звук. Как же его достать? Стоит отметить, что динамик может попасть к вам в руки разными путями. Главное — это иметь данные о его технических показателях. Ведь от них будет зависеть проектировка корпуса, а это очень важно.

Динамик — одна из важнейших частей сабвуфера

Итак. Что касается показателей, то необходимо в первую очередь получить данные о частоте резонанса динамика, который у вас оказался, в открытом пространстве. Кроме того, необходимо также узнать данные об эквивалентном объёме. Если таких данных нет, то лучше пойти и купить динамик в магазине, где его и снабдят специальными документами. Можно выбрать динамик самый скромный или же дорогой. Здесь всё будет зависеть только от вас.

Теперь второй этап, называемый проектировкой короба сабвуфера. Можно воспользоваться специальной компьютерной программой WinlSD 0.44. Эта утилита реально поможет сделать всё правильно. Именно она и потребует внести данные динамика, его параметры. И компьютерная программа такого типа позволяет изготовить короб четырёх видов. Мы рассмотрим короб, имеющий самый высокий КПД. Другими словами, бандпасс 6-го уровня.

Бандпасс шестого уровня представляет собой прямоугольный кубический объект, внутри которого имеется одна перемычка. Именно на неё и будет фиксироваться наш динамик. К тому же у такого бандпасса имеются два отверстия, которые предназначены для монтажа фазоинверторных камер. Вместо камер можно использовать различные трубки. Например, это могут быть трубки из полиэтилена, металла или просто бумаги. Стоит отметить, что корпус обязан быть полностью загерметизирован и сделать это можно с помощью войлока, поролона или же обычной ваты.

Пример проекта корпуса сабвуфера

Что касается слоя герметика, то внутри он должен иметь два сантиметра. А крыша сабвуфера должна быть обязательно съёмной и иметь высокую плотность на стыке. Поэтому её ещё и дополнительно усиливают слоем поролона.

Компьютерная утилита поможет все размеры правильно подготовить. Она рассчитает оптимальные цифры для корпуса, конечно же, исходя из возможностей динамика. Задачей человека становится в этом случае только всё чётко и грамотно воплотить в реальность. И звук, конечно же, оправдает все ожидания. Он получится чистым и громким.

Считается, что в целом собрать сабвуфер является задачей сложной, если не быть предельно внимательным к различного рода мелочам и нюансам. Человек, собирающий самодельный сабвуфер, должен не только разбираться в акустике, но и иметь способности резчика по дереву, уметь вкручивать саморезы и болты, а также работать с герметиком. Для домашнего умельца — это своеобразный вызов.

Самостоятельное изготовление сабвуфера — решаемая задача

Место для сабвуфера

Теперь про то, куда мы установим наш сабвуфер. Выбираем место для него. Лучшей станет установка его в крыло: правое или левое, решаем сами. Хотя, стоит отметить, что места будет больше в правом крыле, из-за особенностей конфигурации многих автомобилей.

Если мы выбрали динамик средний, то ему для нормальной работы понадобится минимум 28 литров объёма. Что касается конфигурации и объёма самого короба, то здесь придётся поэкспериментировать. Обычно объём получается большой, но это не страшно.

Багажник обкладываем полиэтиленовой плёнкой, после чего обклеиваем малярным скотчем обшивку, обязательно в два слоя. Берём стеклоткань и нарезаем её кусками. В таком случае они должны получиться 200×200.

Обязательно смазываем их эпоксидным клеем и ставим на скотч внахлёст.

Один из примеров установки «саба» в багажнике

Теперь о том, как разводить эпоксидный клей. Правильно будет сделать так: банку смолы и банку отвердителя смешать. Если взять какое-нибудь из этих веществ больше нормы, то клей будет быстро густеть и вы не будете успевать его использовать. Идеальное соотношение — 1:1.

Заднюю стенку самодельного сабвуфера, или саба, обклеиваем тремя или даже четырьмя слоями стеклоткани. Потом ждём, пока всё высохнет. Лучше прождать сутки.

На следующий день нужно будет получившуюся скорлупу снять. Её толщину уже наращиваем вне багажника. Начинаем вклеивать дно сабвуфера. Его верх делаем по форме петель, а переднюю стенку крепим на саморезы. Что касается стыков, то их нужно будет промазать эпоксидным клеем.

Саб установлен между сиденьями

Тонкая работа

После того как готов корпус самодельного саба, нужно его подготовить под акустический терминал, то бишь динамик. Для этого нужно на одной из его боковых стенок наметить отверстие. Сделать это можно обычным школьным циркулем.

Мощные сабвуферы для автомобиля получаются в том случае, если его экранируют небольшой коробочкой. Это уже не азы самодельного конструирования сабвуферов, а настоящее искусство. Таким образом, нам удастся устранить различные призвуки, которые возникнут из-за достаточно хлипкого акустического терминала.

Коробочка может иметь квадратную форму. Её обрабатываем клеем ПВА и прикручиваем к боковине, где было вырезано отверстие, с помощью саморезов.

Теперь нужно взять рубанок и срезать им все выступающие края корпуса. Когда выше было сказано про особые навыки, то это было сделано неспроста. И здесь нужно иметь мастерство плотника, чтобы с работой справится на пять с плюсом.

Идём дальше. Берём лобзик, желательно электрический, чтобы удобнее было работать, и вырезаем в передней панели отверстие. Оно будет нужно для установки туда динамика, крепящегося там на саморезах и клею. Если помнит читатель, внутри нашего короба, или бандпасса шестого уровня, имеется перемычка. Здесь и нужно будет вырезать.

Самодельный сабвуфер

Меры по защите

Всё вроде готово, и дилетант сразу же поспешит к подключению. Но спешить мастеру ни к чему, каждый шаг в работе для него — это возможность прикоснуться к возвышенному искусству. Так, и в этом случае не стоит забывать про защиту самодельного творения от влаги и конденсата. Ещё средневековому человеку было известно, что влага на дерево, а в этом случае тонкий ДСП, действует разрушающе.

Чтобы заранее обезопасить и защитить корпус, нужно пропитать его специальным мебельным нитролаком. Процедуру эту желательно проводить на свежем воздухе, во избежание отравления лаком.

Пропитывать не забывайте и внутренний торец передней панели.

Видео, демонстрирующее самостоятельное изготовление сабвуфера:

Ну вроде всё. Пора изучить схемы сабвуфера и подключить. Хотя для более эффектного финиша полезно обшить наш сабвуфер каким-нибудь материалом для красоты. Если у вас в салоне автомобиля имеется карпет, то он и может стать тем самым материалом.

Делаем качественный сабвуфер для автомобиля своими руками

Сабвуфер представляет собой отдельно установленную акустическую систему, которая предназначается для воспроизведения низкочастотных звуковых волн в диапазоне 20-120 Гц. Он звучит только на низких частотах, когда основная акустическая система только на высоких и средних. Низкочастотный звук нераспознаваем человеческим ухом, поэтому его можно монтировать в любом месте салона автомобиля. Самостоятельное изготовление сабвуфера – занятие вполне несложное. Начинать необходимо с покупки динамиков.

Виды сабвуферов

Выделяют пассивные и активные сабвуферы.

Пассивный сабвуфер представляет собой корпус с вмонтированным в него динамиком. Для корректной работы сабвуфера такого типа необходим внешний усилитель с достаточной мощностью.

Активный сабвуфер идёт с уже встроенным в него собственным усилителем низкой частоты с возможностью регулирования громкости. Многие активные сабвуферы имеют также регуляторы басов и обрезания высоких звуковых частот. Это необходимо, чтобы звук с сабвуфера согласовывался с акустической системой. Самый существенный недостаток такого вида сабвуферов – это его высокая цена.

Интересно знать! В 1998 году российские мастера компании «Автолюкс» создали «Блюзмобиль» из Nissan Terrano II. Его оборудовали четырьмя усилителями, шестью динамиками и девятью сабвуферами, совокупным звуковым давлением в 147 дБ. За этим монстром закреплён официальный рекорд в 135,9 дБ. Но и этого вполне достаточно, чтобы прочувствовать, как ваши внутренние органы «гуляют» по телу.

Выбираем динамики для сабвуфера

Как правило, в сабвуферах используются динамики следующих размеров:

Шестидюймовые динамики, используемые как дополнительные источники средних басовых частот.

Восьмидюймовые динамики, используемые для получения фронтальных басов.

Десятидюймовые динамики отлично раскрывают свой потенциал в закрытом корпусе объёмом 15-20 литров. Таким образом получается хороший сабвуфер компактных размеров с оптимальным звуковым давлением.

Двенадцатидюймовые динамики являются оптимальными для корпусов от 25 до 35 литров. Это, пожалуй, наиболее оптимальный вариант.

Пятнадцатидюймовые динамики зачастую используются на соревнованиях по звуковому давлению SPL. Они встраиваются только в корпуса от 60 до 90 литров, а такой аппарат поместится не в каждый автомобиль.

Основа разности сопротивлений в катушке звука действует по принципу: чем меньшим сопротивлением нагрузки обладает усилитель, тем выше у него мощность. Нагрузка в 1-2 Ом приводит к ухудшению качества звучания. Рекомендуется выбирать вдвое большую нагрузку в 2-4 Ом.

Ни специалисты, ни любители пока не сошлись в едином мнении относительно мощностных характеристик динамиков. Но что можно с уверенностью подтвердить, так это необходимость в выборе динамика, превосходящего по мощности усилитель. Никакая аудиосистема не приспособлена к длительной работе на пиковых мощностях. Это ведёт к повышению нелинейных искажений и сильному занижению качества воспроизводимых звуковых сигналов. Поэтому следует придерживаться некого баланса.

Это интересно! Самый дорогой из существующих ламповых усилителей продаётся до сих пор в Москве. Это Audio Note Ongaku, и его стоимость составляет $39,9 тыс.

Выбираем параметры динамика

Теперь пришло время к созданию виртуальной модели самодельного сабвуфера. Проект будущего ящика лучше проводить программой WinISD 0.44, но для этого потребуются некоторые характеристики динамика, а точнее параметров Тиля-Смолла:

Qts — добротность динамика;

Fs — резонансная частота в открытом пространстве;

Vas — эквивалентный объем.

С параметром Fs у вас проблем не будет. Для ГДН35 Fs будет 38 Гц, для ГДН50 — 40 Гц, а для ГДН75 равен 25-35 Гц. Если динамик фирменный и заграничного производства, то его параметры с лёгкостью можно найти в базе данных WinISD 0.44.

При расчёте корпуса ящика сабвуфера самым важным параметром является Qts. Данный параметр определяет отношение передаточной функции динамика частоты Fs к передаточной функции на тех частотах, АЧХ которых является горизонтальной. Если сказать иначе, на частотах, что выше Fs, Qts определяет эффективность динамика на резонансной частоте. Проблема лишь в том, что низкочастотные динамики, например, стандарта ГДН, производятся в различных местах, да и параметры сильно разнятся у разных производителей.

При расчёте ящика для сабвуфера необходимо взять во внимание все возможные вариации значений Qts и добавить отходные варианты. Во многих источниках указываются такие параметры:

• 35ГДН-1-8 Qts = 0,4;

• 35ГДН-1-4 Qts = 1±0,5;

• 50ГДН-42Д Qts = 1±0,5;

• 75ГДН-1-4 Qts = 0,2-0,5.

Vas — не является особо важным параметром, который влияет на расчёты. Его можно считать равным следующим:

• ГДН35 — 40-50 л.;

• ГДН50 — 90 л.;

• ГДН75 — 80 л.

Проектирование ящика для сабвуфера с помощью ПО

Следующий этап изготовления сабвуфера своими руками заключается в выборе типа ящика. При помощи программы можно создать проекты четырёх видов ящиков:

• закрытый ящик;

• фазоинвертор;

• бандпас 4-го порядка;

• бандпас 6-го порядка.

У каждого динамика имеются свои как положительные, так и отрицательные стороны. Выбор ящика, по большей степени, следует осуществлять отталкиваясь от самого выбранного динамика. Какой именно ящик подойдёт к динамику лучшего всего, поможет разобраться программа.

Прежде чем создавать проект ящика сабвуфера, нужно смоделировать динамик с параметрами, заложенными в базу данных. Нажмите «New», затем выберете «Own drivers», после чего снова «New», и загрузите свои параметры. Потом подтвердите – «ОК» и закройте – «Close». После создавайте проект на основе этого динамика. Повторите процедуру несколько раз с использованием различных видов ящиков.

Проектирование заключается в варьировании размеров ящиков и настройке частоты фазоинверторов. Программа реагирует на изменения, которые вы вносите, и меняет график звучания в реальном времени в зависимости от частоты. Для настройки частоты фазоинвертора изменяется длина труб и их диаметр. Следите, чтобы размер труб не получился слишком большим, об этом просигнализирует поле Vent mach, которое озарится красным. Идеальным считается тот график, что пересекает линию в -3 дБ на частоте 25-35 Гц, а далее проходит по линии в 0 дБ и спадает до 150-200 Гц. Далее проектирование будет заключено в поиске возможных отклонений.

Виды конструкции короба

Выделяют четыре наиболее популярных вида ящиков для сабвуфера. Конструктивные особенности коробов напрямую влияют на качество звука, получаемого на выходе. Далее вкратце расскажем о них:

Закрытый ящик является самым простым вариантом в моделировании и изготовлении. По сути его название и выражает его суть. Динамик сабвуфера помещается в закрытый деревянный корпус, улучшающий его акустические характеристики. Не составит труда сделать такой корпус, но вот КПД у него самый низкий из всех представленных.

Бандпас 4-го порядка представляет собой корпус, разделённый на камеры, разные по объёму. В одну из них помещён динамик, а в другую воздуховод. Особенность данной конструкции сабвуфера заключается в возможности ограничения частот, воспроизводимых диффузором.

Бандпас 6-го порядка отличается от предыдущего только тем, что имеет ещё один дополнительный воздуховод. Данный тип конструкции – наиболее сложный в проектировании и создании, зато имеет максимальный уровень КПД.

Фазоинвертор – корпус с вмонтированной в него трубкой, выводящей воздух. За счёт этой трубки дополнительно исходит звук от задней части сабвуфера. По качеству звуковых характеристик и сложности изготовления данный тип можно поставить между «ЗЯ» и «Бандпасом».

Чертежи корпуса сабвуфера

Для примера разберём схему. В данной статье мы будем делать короб под сабвуфер с 12-ти дюймовым динамиком. Объём конструкции под него должен составлять 40-50 литров. Рассчитать корпус под сабвуфер не представляет сложности. Вот примерная схема для этого. Только обратите внимание на минимальное расстояние от динамика до стенок ящика. Оно, как весь объём конструкции, просчитывается по внутренней поверхности.

Выбор материала и требуемые инструменты

Необходимые материалы, для создания корпуса сабвуфера:

• Динамики, выбирая которые, необходимо знать отличие в их характеристиках. Обычно в инструкции или на коробке обозначается рекомендуемое оформление именно для данного динамика.

• Лист фанеры, ДВП, ДСП. Количество необходимо просчитать, исходя из размеров будущего корпуса.

• Акустический терминал. Необязательный элемент. Можно просто просверлить пару отверстий, через которые вывести наружу провода из динамика.

• Акустический кабель.

• Герметик либо ПВА.

• Саморезы для дерева.

• Эпоксидная смола.

• Лак либо краска.

• Клей для карпета. Удобен тот, что в баллончике.

• Для фазоинверторного корпуса необходим туннель подходящего размера. Если вы не найдёте нужного в продаже, тогда в магазине строительных материалов приобретите трубу нужного материала. Подойдёт пластиковая, картонная и даже металлическая.

Необходимые инструменты, для создания корпуса сабвуфера:

• Лобзик.

• Шуруповёрт, если нет – отвёртка.

• Рулетка.

• Карандаш или маркер.

• Карпет или другой материал для наружной обтяжки корпуса.

• Ножницы.

Этапы изготовления корпуса

1. Вырежьте стенки корпуса относительно его размеров. Вырезать необходимо, соблюдая размеры, тщательно вымеряя. При сборке щели должны быть минимальные, в идеале части корпуса должны прилегать максимально плотно друг к другу.

2. Промажьте стыки стенок герметиком и соедините их вместе. Закрепите далее их саморезами с шагом в пять сантиметров.

3. Повторно промажьте стыки как снаружи, так и внутри. Не допускайте даже малейших дырочек, так как через них будет слышаться свист при работе сабвуфера.

4. Вырежьте в удобном месте отверстие для акустического терминала.

5. Вырежьте лобзиком отверстие для динамика.

6. Если ящик предусмотрен под фазоинверторный сабвуфер, тогда в соответствующее отверстие на эпоксидную смолу садится соответствующий порт.

7. Для защиты корпуса от влаги, его необходимо покрыть лаком либо краской.

8. Обтяните корпус карпетом или другим материалом, оставляя отверстия под динамик, порт и терминал.

9. Поставьте терминал на своё место и закрепите его саморезами, дополнительно промажьте эпоксидкой.

10. Закрепите на клеммы провода внутри терминала. Второй стороной провода подсоедините к клеммам на динамике. Провода не должны провисать. Длины должно хватать именно для подсоединения.

11. Смонтируйте динамик на место. Стык между динамиком и ящиком уплотните прокладкой. Если такая не шла в комплекте с динамиком, можно использовать поролон или оконный уплотнитель.

12. Закрепите динамик к корпусу саморезами, которые шли с ним в комплекте или любыми другими подходящими.

Изготовление корпуса

Теперь подробнее поговорим о том, как самостоятельно изготовить сабвуфер и монтировать его на автомобиль. Наиболее удобная и универсальная форма корпуса – это немного усечённая пирамида. Так как у большинства автомобилей в стандартном положении заднее сиденье располагается под наклоном в 23 градуса, поэтому задняя стенка сабвуфера наклонена под таким же углом. После определения необходимого пространства, рассчитайте размер корпуса и нарисуйте чертёж корпуса будущего деревянного корпуса.

Закрытый ящик

Переднюю стенку лучше изготовить из ДСП толщиной 23 мм, боковую – 20 мм. Выпилите из материала стенки по размерам, что в чертеже, а затем соберите корпус. Все соединения лучше смазать клеем и закрепить саморезами. Отверстия под них лучше высверлить в 3 мм, а под головки лучше взять сверло диаметром в 1 см. Далее на боковой стороне циркулем сделайте разметку под будущий акустический терминал. Вырежьте их электролобзиком. Терминал под высоким давлением может издавать лишние звуки. Во избежание этого экранируйте его маленькой коробочкой, затем промажьте соединения клеем и закрепите саморезами. Рубанком срежьте все лишние выступы.

Спереди аналогичным способом разметьте и вырежьте отверстие под динамик. Для защиты от влаги пропитайте корпус нитролаком. Также его можно нанести на внутренний торец передней панели. Для большей привлекательности и практичности корпус можно снаружи оклеить карпетом. Клеится он на тот же нитролак. Присоедините динамик к акустическому терминалу и прикрепите их корпусу.

Фазоинвертор

Корпуса для данного типа сабвуферов достаточно громоздкие. Такой сабвуфер сложно рассчитать и настроить, но такой самодельный элемент автомобильной акустической системы имеет более высокий КПД, чем предыдущий вариант. В данном случае параметры также просчитываются при помощи специального программного обеспечения. Сборка корпуса проводится, как в предыдущем варианте, только его необходимо также тщательно отшлифовать. Далее вырежьте отверстия под фазоинвертор, ручки-карманы и розетку. Установите все крепления и хорошо их проверьте. Корпус можно обтянуть кожей.

Бандпас 4-го порядка

За изготовление корпуса для данного типа сабвуфера стоит браться тем, кто имеет опыт в проведении просчётов, ведь его сложно рассчитать и легко ошибиться в размерах. Зато бандпас выдаёт замечательный звук и имеет хороший КПД. Кроме этого, он хорошо защищён от внешних механических повреждений, так как полностью спрятан в корпус. Расчеты проводятся также при помощи компьютерного ПО, но не только всего корпуса целиком, но и каждой из камер отдельно. Когда будете выпиливать детали, придерживайтесь как можно точнее всех размеров.

Конструкция собирается, как и в предыдущих вариантах. Перегородка с динамиком делается из двух листов ДСП. Изнутри корпус обклеивается шумопоглощающим материалом, ватином, например. Клей наносится небольшими штрихами по всей площади. Нельзя лить много клея во избежание возникновения статических свойств. Можно дополнительно закрепить конструкцию строительным степлером. Припаяйте провода к клемме и динамику. Заднюю камеру необходимо полностью загерметизировать. Наибольшая герметичность достигается благодаря жидким гвоздям и скотчу, наклеенному поверх шва.

Раструб фазоинвертора делается путём нагревания краёв при помощи банки и их расширения. В пропиленное лобзиком в крышке отверстие помещается карпет с фазоинвертором. Соединения промажьте жидкими гвоздями. Крышка с фазоинвертором сзади обклеивается шумопоглощающим материалом. Готовый сабвуфер соберите и обклейте карпетом.

Бандпас 6-го порядка

Это самый сложный в сборке и расчётах сабвуфер. Сюда без основательной подготовки не стоит и подходить. Сравним с предыдущим вариантом, но выдаёт гораздо больший частотный диапазон. КПД и мощность его тяжело рассчитывать даже с помощью имитационных программ. Как правило, все параметры подбираются исключительно по личным предпочтениям.

Конструкция корпуса многим сложнее, чем в предыдущих вариантах. Чтобы соединения вышли значительно прочнее, их выполняют из деревянных брусков, закрепляющихся саморезами. Все детали вырезайте строго по просчитанным размерам. Всё делается далее по технологии, аналогичной с бандпасом четвёртым, только в качестве дополнительного звукоизоляционного материала используйте вату.

Это интересно! Рекордсмен Книги рекордов Гиннеса Тим Стормз воспроизводит ноту соль субконтроктавы на частоте 0.189 Гц. Этот звук настолько низок, что даже сам певец его не может услышать.

Самодельный сабвуфер-стелс

Данный тип сабвуфера максимально спрятан и почти не занимает в багажнике место, поэтому его очень удобно использовать в автомобиле. Он устанавливается обычно в багажнике за задней аркой. Для хорошего динамика требуется корпус в 18 литров, а порой и больше. Корпус можно слегка вынести вовнутрь багажника, а также разместить сабвуфер в нише, которая предназначена для «запаски».

Монтируя сабвуфер-стелс, необходимо его переднюю панель немного выдвинуть и соединить с обивкой багажного отделения. Из гофрированного картона необходимо соорудить форму, склеив его куски малярным скотчем. Соберите каркас усилителя и примерьте оборудование. Далее сделайте облицовочную панель из стеклопластика для усилителей, которые уже установлены на каркасе.

Закройте все промежуточные места между пластиком скотчем и полиэтиленом. Затем всё прикручивается саморезами к коробке корпуса. Гофрированный картон используется в качестве опалубки, для устранения зазоров в корпусе. Для придания более привлекательного внешнего вида необходимо воспользоваться стеклопластиком и шпаклёвкой. Установите сабвуфер в заднее крыло и выровняйте неровности наждаком. Обклейте корпус карпетом и прикрепите динамик.

Подсветка на сабвуфере

Для подсветки сабвуфера можно использовать как светодиоды, так и диодную ленту. У светодиодов имеются два контакта: анодный (А) и катодный (К). Для правильного подключения светодиодов необходимо присоединить контакт А к плюсу на питании, К – к минусу. К Аноду припаиваются резисторы каждого по отдельности светодиода. Заранее определите, как будете крепить светодиоды внутри сабвуфера. Лучше их разместить так, чтобы они держались вместе и крепко. Датчик эквалайзера необходимо располагать от сабвуфера подальше, чтобы он не повредился.

Если в качестве подсветки применять светодиодную ленту, то закрепление диодов заменено монтажом ленты. Это облегчит вам установку, так как они уже тщательно подогнаны друг к другу и хорошо закреплены. Монтировать ленту достаточно просто внутрь сабвуфера на двусторонний скотч. При помощи этого варианта можно варьировать различные дизайнерские решения. Например, кольцо из светодиодов вокруг динамика, яркость и цвет которого можно подобрать как вам угодно.

Каждый автовладелец, который тюнингует свой автомобиль, руководствуется по большей части только своими предпочтениями, вкусом и фантазией. То, что советуют специалисты, принимается, как правило, в качестве рекомендаций. То же самое можно сказать о том, как создавать сабвуферы самостоятельно с дальнейшей их установкой.

Подписывайтесь на наши ленты в таких социальных сетях как, Facebook, Вконтакте, Instagram, Pinterest, Yandex Zen, Twitter и Telegram: все самые интересные автомобильные события собранные в одном месте.

Активный сабвуфер для машины/дома своими руками

Приветствую, Самоделкины!
Сегодня поговорим про изготовление активного сабвуфера для автомобиля или для дома. Несмотря на небольшую мощность и габариты, наш сегодняшний сабвуфер звучит лучше, чем Х230 от фирмы Logitech, у которого заявлены 52 ватта мощности. У нашего же, пока не скажу какая мощность, об этом и о многом другом поговорим сегодня в данной статье.

Итак, давайте начинать. Именно активный саб, означает то, что он имеет встроенный усилитель мощности, плюс в нашем случае кроссовер. Кроссовер позволяет отфильтровать высокие частоты, и передавая только низкие частоты усилителю, они усиливаются и излучаются НЧ головкой.

Поэтапные шаги здесь в принципе универсальны и могут быть использованы для сборки какого-нибудь саба побольше.


Автор же хотел сделать малогабаритную сборку, потому и использовал вот такой вот маленький усилитель от blitzwolf, тогда, когда он был еще в продаже.

Также на руках был и другой усилок от sony, таких же габаритов, и это совсем не потому, что не было усилков помощнее, просто он их оставил под какой-нибудь другой проект.

Ну а в сегодняшнем проекте, как уже сказал, важна компактность. И, кстати, вот, что показал шумометр:

Так же в описании под видеороликом вы найдете ссылки на готовые блоки усилителей, начиная от 30 ватт, и достигая якобы 600 ватт.


Итак, для сегодняшнего проекта автор использует 5-дюймовый низкочастотный динамик.


Обычно при выборе динамика производитель всегда указывает параметры Тиля – Смолла, они просто необходимы для дальнейших расчетов, но конечно же не в нашем случае.

Автору же достался драйвер от какого-то домашнего кинотеатра и вся инфа по нему — это 8 Ом, 35 Ватт.

Поэтому некоторые параметры приходится рассчитывать самостоятельно, ну или хотя бы попытаться определять резонансы на слух. Это конечно не совсем правильно, акустика дело такое — требует правильного подхода и знаний, но про них как-нибудь в другой раз. Не хочу сегодня о тяжелой теории, предлагаю лучше начать с расчёта короба. По стандартной таблице можно выбрать предлагаемый объем коробки. Тут предложили 0,35 Фута, okей.

Далее высчитываем размеры стен корпуса. Желательно какие-нибудь простые цифры, чтобы можно было заказать у столяра, либо самостоятельно все выпилить.

Также, прошу внимание!, при внешних расчетах соблюдаем внутренний объем корпуса, а значит толщина стенок играет большую роль.

Ну и как-то так зародился домик для сегодняшнего проекта, который любезно приютит в себе все сегодняшние комплектующие.


Размеры потом вам покажу. Все четкая картинка нарисовалась, а значит можно сделать заказ.

Это у нас: перед, зад, верх, низ и бока:


Корпус будет собираться на 25мм саморезах для дерева, их логично ставить не шире чем сантиметров через 10, и забегая немного вперед, хорошо было бы закруглить углы на стенках. Это можно сделать либо вручную — наждачкой, либо использовать фрезер — так будет лучше.

Ну, а вот, как и обещал, размеры стенок:

Так, хорошо, теперь займемся сборкой самой коробки. На одной из стенок находим ровно центр. Для этого рисуем с угла до угла полоски, там, где они пересекаются — это и есть искомый нами центр.

Рисуем круг диаметром нашего динамика, и сверлим где-нибудь отверстие, для того чтобы просунуть пилочку лобзика.


Электролобзиком выпиливаем круг для динамика.

Круг получается не совсем ровным, но есть и другие точные решения, про которые поговорим как-нибудь в другой раз. Далее делаем направляющие отверстия для саморезов и собираем коробку, но пока что без клея.

Предварительно можно отзинковать отверстия, чтобы спрятать шляпки саморезов.

Теперь поговорим про фазоинвертор.

Настраивать будем на частоту 40 Гц. Где-то вычитал, что диагональ трубы фазоинвертора должна быть примерно 1/3 от динамика, в моем случае, это около 45-ти мм.


У автора как раз была такая канализационная труба, только я вот не учел, что 1/3 должна была быть от подвижной части динамика, а не от края до края, но по звучанию минусов не обнаружено, а это самое главное.

Сверлиться будем коронкой диаметром 54 мм (как всегда, нужного размера нет), а это на 9 мм больше, поэтому была сделана 3d модель, которая, во-первых, поможет соединить отверстие с трубой, а во-вторых, сгладить течение воздуха.


Далее отпиливаем ПВХ трубу нужной длины, красим с внутренней стороны черной краской.

Как раз к этому времени деталь отпечаталась. Вставляется она конечно очень плотно, но дополнительно можно еще и заклеить. Пару капель супер-клея будет вполне достаточно.


Теперь поработаем над визуалом и над установкой этой платы с усилителем в саб. Можно было поставить усилок снаружи корпуса, но это было бы не то. Было решено его как-то интегрировать в корпус. Для этого необходимо было сделать кастомную панель.


И когда панель была готова, начал подготавливать для неё гнездо в корпусе.

Итак, отверстие пробили, теперь прикроем желтый цвет орг стекла карбоновой наклейкой, ну и после чего все собираем.

Переходим дальше. Затираем коробку и пересобираем ее, но только на этот раз уже с использованием клея.

Клеем и прикручиваем 4 стенки и ту, которая с динамиком.


А вот заднюю стенку оставляем просто на саморезах.

Кстати, если коробка большая, необходимо вклеить дополнительные перегородки для жесткости. Далее устанавливаем сам динамик, проводим провода, устанавливаем блок с усилителем, подключаемся к динамику и устанавливаем фазоинвертор (его можно вклеить либо на термоклей, либо на силикон).



Ну и наконец, на заднюю стенку я наклеил немного поролона для изоляции.

Все! А, ножки, еще же ножки. Ножки автор использовал тоже заказанные из Китая (тоже ссылки для вас в описании под видеороликом в конце статьи).


Они довольно мягкие и вибрации от колонки не передаются на стол или на пол.
Все, вот теперь все в сборе. Провод от радио я намотал на трубу фазоинвертора, но это типа чтобы приемник ловил лучше.

Теперь можно прикручивать заднюю стенку. Под конец подкручиваем гайки на потенциометрах и одеваем на них ручки.


Все блок полностью готов, да и сам сабвуфер тоже, погнали в машину – затестим.


Этот сабвуфер давно собран и проверен перед публикацией (в данном случае с апреля 2018 года). Даже в летние дни, на полных газах, усилок сильно не греется, ну и конечно из-за маленьких размеров помещается куда угодно.

А вес у него при этом меньше 5-ти кг.

Такой усилитель довольно универсальный, питается ведь от 12В, а значит подходит и для машины, и для домашнего использования.

Благодарю за внимание. До новых встреч!

Видео:


Источник (Source) Становитесь автором сайта, публикуйте собственные статьи, описания самоделок с оплатой за текст. Подробнее здесь.

САМОДЕЛЬНЫЙ САБВУФЕР

   Покупка хорошего усилителя и самого сабвуфера для авто может потянуть на несколько сотен долларов. С другой стороны, если вы имеете хотя бы начальные познания в электронике, можно сделать всё это своими руками. И самый простой вариант автомобильного усилителя для сабвуфера — многократно проверенная схема на УМЗЧ TDA1562.


   Вот технические характеристики микросхемы TDA1562:
 Напряжение питания – 8..18в;
 Пиковое значение выходного тока – 10А;
 Ток в режиме покоя – 0,15А;
 Сопротивление нагрузки – 4 Ом;
 Выходная мощность, при коэффициенте гармоник
 -0,03% — 1 Вт
 -0,06% — 20 Вт
 -0,5% — 55 Вт
 -10% — 70 Вт
 Коэффициент усиления по напряжению – 26 дБ
 Диапазон воспроизводимых частот – 16…20000 Гц
 Входное сопротивление – 10 кОм
 Цена TDA1562 — примерно 6уе.

   Эта микросхема представляет собой УНЧ с вольтдобавкой, суть которой сводится к тому, что при воспроизведении звуковых сигналов, высокая выходная мощность требуется на короткий промежуток времени, а остальное время выходная мощность остается небольшой. Поэтому пока выходная мощность не превышает 18Вт, устройство функционирует как обычный УНЧ с питанием от источника 12В. При превышении выходной мощности 18Вт внутреннее напряжение питания кратковременно повышается при помощи преобразователя в состав которого входят конденсаторы вольтодобавки. Подобное решение позволяет получить на нагрузке большую пиковую мощность при стандартном питании бортовой сети авто — 12В. 


   Замыканием контактов осуществляется перевод микросхемы из дежурного режима в рабочий и наоборот. Усилитель не рекомендуется подключать к сабвуферам со встроенными фильтрами, содержащие значительные емкости. Микросхема TDA1562 довольно чувствительна к напряжению питания, поэтому не подавайте на неё больше 18В. Усилитель развивает выходную мощность 70Вт на нагрузке 4Ом при питании от однополярного источника напряжением 15В.


   Для монтажа микросхемы используйте толстые провода, так как имеет место потребление тока до 10 ампер. Это относится и к проводам идущим к динамику сабвуфера, ведь даже небольшое увеличение сопротивления линии приведёт к потерям мощности.


    Микросхему усилителя самодельного сабвуфера необходимо установить на теплоотвод площадью не менее 500 см2. В качестве радиатора можно использовать металлический корпус или шасси авто. Как вариант можно задействовать принудительный обдув микросхемы 12-ти вольтовым кулером от компьютерного БП.


   Корпус сабвуфера делаем из ДВП достаточной толщины — чтоб не было дребезга и призвуков. Снаружи обклеиваем его мягкой тканью для вибропоглощения. В качестве разъёмов используем стандартные тюльпаны и пружинящие педальки.


   Для индикации режимов сабвуфера служат два светодиода. Зелёный показывает подачу питающего напряжения 12В на схему, а красный сигнализирует о перегрузках и срабатывании защиты в TDA1562


   Питание 12В нужно прикрутить винтами — для улучшения контакта и уменьшения потерь. Испытания готового сабвуфера показали, что звук не хуже фирменных сабов среднего ценового диапазона, и вполне возможно собрать своими руками хорошую бас — систему в авто всего за 35уе и два вечера. Материал прислал — in_sane

   Форум по сабвуферам

   Форум по обсуждению материала САМОДЕЛЬНЫЙ САБВУФЕР

Самодельный бюджетный саб для кино / Хабр

Зачем все это делалось?

Давно я задумался изготовлением «бУхалки» для кино в виде активного саба на LFE канал.
В качестве НЧ 30ГД-2 (НЧ от S90), так как такие есть в наличии и валяются без дела в больших количествах (ну и стоят копейки в нужных местах, так что не жалко). Ну и нищеброд я :), жалко мне за приличный саб больше 15 000 р. отдавать. По расчетам я решил выбрать бандпасс 6А. Только он дает очень приличную отдачу и низкую граничную частоту. По расчетная АЧХ уровню -3дб — 24 -63 Гц. Собранный саб выглядит так.

Качество фот в основном ужасное, так как фотографировал на телефон (ну не имел я ни мыльницы ни зеркалки в то время).
Кому интересно добро пожаловать под кат. Там очень много фот.

Конструкция

Общая конструкция очень похожа на общеизвестную конструкцию в инете.
Это пример внешнего вида с одного сайта (авторство картинки не укажу, так как не помню где брал фото, если кто знает напишите в личку, поставлю ссылку). Естественно размеры будут совершенно другие.

Для изготовления конструкции необходимо знать или получить параметры конкретного динамика. Их называют Параметры Тиля—Смолла. Если вы не знаете, что это, то гугл и вики вам в помощь, измеряется все достаточно просто, софт и методы гуглятся на ура. Не весь софт бесплатен, но скажу что измерить можно имея точный вольтметр, точные весы, пластилин, генератор и усилитель. Гуглится по «метод добавочной массы». Я пользовался методом добавочной массы, но автоматизировал измерения соответствующим софтом (название не указываю так как софт платен, но мы в России, кому надо тот все найдет ;)).
Измеренные параметры приводить нет смысла, ибо каждый динамик уникален и сборка конструкции по «чужим параметрам» ни к чему хорошему не приведет. Как бы сказать про динамики времен СССР, чтоб не грубо было…
У меня 4 НЧ динамика и все имеют абсолютно разные параметры, хотя они одной марки.
Для желающих указать и «похоливарить», что «качественного» звука от бандпасса не добиться, еще раз повторю саб собирался для просмотра фильмов и для озвучивания LFE канала, в котором идут в основном только эффекты.
Расчеты

Вот расчетные чертежи корпуса и расчетная АЧХ, все рассчитано под конкретный динамик.
Расчеты совпадают в 4 мне известных программах.
Я брал как основную программу расчета Bass box pro

Расчеты на потери полезного объема корпуса

«Пилите, Шура, пилите»

После всех расчетов, заказал распил ДСП в одной фирме которая занимается мебелью, обошлось все очень дешево
Вот средняя перегородка для крепления динамика.

Боковые стенки

на заднем плане видно инструмент сверления, ох и заколебался я сверлить.

Боковая стенка с брусками для усиления и крепежа.

Пытаемся все собрать в единую конструкцию

Примерим фазоинвертор из канализационной трубы

Покроем стенки звукопоглотителем

А так с динамиком

Электронная начинка

Предварительный усилитель собирал по схеме www.electroclub.info/samodel/sub_pred.htm
Печатку нарисовал сам под smd резисторы ну и уменьшил её в размерах. Если она кому-то интересна, то могу выложить в формате Sprint Layout.
В качестве оконечного усилителя выбрал усилитель на TDA7294 с регулируемым выходным сопротивлением.
Схема и описание тут. Печатка использовалась от автора. Чтобы не лазить далеко схема с первоисточника:

Процесс изготовления печаток подробно описывать не буду приведу только готовый результат. Делал ЛУТом (Лазерно Утюжная Технология). В качестве материала для переноса — нарезанные листы журнала PC Week.
Плата предварительного усилителя готовая к травлению и после протравки в хлорном железе.


Плата оконечного усилителя на TDA7294

Собрал почти полностью УНЧ, не хватило пары омических сопротивлений и одного оксидника и собрал предварительный усилитель с сабсоник фильтром и ФНЧ кроссовером с изменяемой частотой и переключателем фазы. На плате так же есть корректор Линквица, но он не распаян, так как для оформления бандпасса он не нужен. На фотках платы не отмыты от флюса, поэтому такие «красивые».

Оконечный усилитель


Предварительный усилитель

Наборчик собери сабвуфер

Берем кусок алюминия размечаем и делаем заднюю панель блока усилителей

Не забываем о плавкой вставке, в качестве радиатора что-то из запасов от проца AMD

Плата оконечного усилителя

Сделали все соединения

Питание из какого-то старого транса, опять мотанного самим. Трансформатор в древности стоял в каком-то ламповом телевизоре пока не попал ко мне в руки и не был перемотан для какого-то усилителя, давно это было). Питание на оконечник +- 35 В.

Так как такой вид несколько не симпатичный то красим все черной матовой краской из баллончика

Ставим свителки-перделки

Тру сабву́фер должен стоят на шипах. Шипы были заказаны отцу токарю. Вот такие получились

Примерим

И закрепим их

Делаем саб в меру красивым и симпатичным

Приведу для начала фотки промежуточного результата. Из них видно что такой саб не станет украшением квартиры. Ну ничего мы это исправим.


Без крышки

Достал виброшлифмашинку, зашпаклевал дырки от шурупов, выровнял корпус и начал обклеивать самоклейкой под светлое дерево. Сначала купил самоклейку для оклеивания в один слой. Изначально задумка была светлый корпус и черные матовые детали. После первого слоя стало ясно что один слой очень мало.
Первый слой


Попробовал покрыть дно лаком, стало хорошо видно что один слой просто просвечивает.

Пришлось еще раз идти в магазин за пленкой. Второй слой наклеивал веселее, так как помогала жена. В четыре руки клеить намного легче.


После двух слоев пленку начал покрывать лаком. Марку лака сейчас не вспомню, помню что быстросохнущий и вроде разбавлял ацетоном. Стоил около 50 р за банку так как просроченный :), но нам пофиг мы нищеброды.
Два слоя лака

После просушки он выглядит так

Ближе

Сколько же это стоит?

600 р — напилили мне детали на корпус + материал + доставка до дома.
100 р — шурупы.
120 р — брус
250 р — трубы фазиков + разъем для подключения в итоге оказался лишним и труб много, хватило бы и 50 р.
50 р — герметик (просроченный)
50 р -скульптурный пластилин
200 р — 2 шт TDA7294 (одну спалил по дурости перепутав полярность)
200 р разные мелкие детали которых не было в наличии.
120 р переменные резисторы с ручками
50 р лак (просроченный)
200 р 5 метров самоклейки
100 р шкурка
85 р краска черная матовая
70 р канализационная труба

Итого 2160 р., вроде ничего не забыл

бесплатно — принесли картонную трубу для фазика
бесплатно — НЧ динамик
бесплатно — инструмент

Немного расчетов и размышлений

Расчетное давление что-то около 109 дб в диапазоне работы, при подводимой мощности 50 Вт. Давно считал могу соврать. Расчеты на скорую руку

70 Ватт давление вот такое, как видно есть наклон так как дин фактически работает ниже резонансной частоты, но по графику он не выходит за пределы допустимого хода даже на 20 Гц

100 Вт ситуация та же

Посмотрел ради интереса, что можно в дин и 200 Вт вкачать и на 20 Гц не будет ограничения хода. Можно вплоть до 18 Гц заставить дудеть. Но есть естественный вопрос нужна ли такая мощь? По впечатлениям когда не было отдельного усилка раскачивал его промышленным усилком на 25 Ватт, если сделать на полную — это очень и очень громко. На полную включаю только когда хочу показать кому-либо всю мощь, похвастаться. Так сказать ЧСВ потешить 🙂 Но в таком режиме долго не послушаешь, все что можно трясет и дребезжат стекла, мощно одним словом.

PS Конструкции уже год, делал я её под настроение 3 месяца, в свое удовольствие.
Стоило он того или нет? Я считаю, что да. Бас очень низкий и глубокий. Из-за конструкции саб очень мягко играет, резкую атаку он не сможет отиграть, да и не нужно это ему, зато все LFE эффекты идут просто на ура, все прослушивающие были в диком восторге. Несмотря на то что саб стоит на шипах, стены пол и стекла все равно ощутимо вибрируют создавая эффект не хуже чем в кинотеатрах (убрать бы еще дребезг стекол).
Недавно подарили динамическую головку от автосаба, буду делать еще один, но в этот раз закрытый корпус и с корректором Линквица.

видео и схемы, как самому сделать компактный активный и пассивный автосабвуфер

Акустический усилитель в автомобиле позволяет обеспечить воспроизведение низких частот в высоком качестве. Чтобы сделать сабвуфер в машину своими руками, нужно выбрать динамик, тип корпуса, а также учесть все нюансы по сборке устройства.

Содержание

[ Раскрыть]

[ Скрыть]

Какой нужен динамик?

Выполняя сборку небольшого акустического сабвуфера первое, что надо делать — определиться с типом музыкальной колонки, которая служит базой. Нужно учитывать габариты устройства, а также его технические свойства.

Параметры

  1. Основной характеристикой при выборе динамика для сабвуфера является сопротивление. Если нагрузка на устройство составит около 1-2 Ом, это приведет к снижению качества звучания. Оптимальным вариантом будет покупка динамика с сопротивлением в районе 2-4 Ом. При приобретении устройства важно учесть один нюанс — мощность колонки будет выше, чем параметр у усилителя. Это обусловлено тем, что динамику нужен некий запас прочности в виде разницы, чтобы увеличить его ресурс эксплуатации.
  2. Если на руках уже имеется колонка и усилитель, то надо определить разницу в мощностях между этими устройствами. Затем на регуляторе громкости последнего нужно сделать отметку, чтобы ее не превышать. Надо помнить о том, что ни один динамик не сохранит качество звучания, функционируя на максимальной громкости. В результате такой эксплуатации произойдет нарушение баланса частот.

Канал «Flexing Studio» рассказал о выборе технических параметров для автомобильного акустического оборудования.

Размеры

Делая сабвуфер в машину своими руками, надо определиться с габаритами устройства:

  1. Колонки диаметром 6 дюймов обычно используются в качестве дополнительного источника средних басов. Их применение позволит обеспечить акустику средним по звучанию сабвуфером. Оптимально использование таких динамиков в салонах небольших автомобилей.
  2. Устройства 8 дюймов рассчитаны на применение в качестве дополнительных фронтальных низких частот. На практике — не лучший вариант для использования в основном сабвуфере.
  3. Динамики на 10 и более дюймов — оптимальный тип. Такие устройства обеспечивают качественное звучание, наполняя свободное пространство корпуса мощной вибрацией. Если динамик установить в «закрытый ящик», это позволит выдавать качественное звуковое давление. Оптимальным вариантом считаются колонки на 12 дюймов и более, их установка допускается в корпусы объемом до 35 литров.
  4. Для салона большого автомобиля рекомендуется использовать устройства на 15 дюймов. Но в плане реализации это сделать сложно, поскольку для такого динамика потребуется корпус объемом около 90 литров.

Канал «D Style Audio. Студия Автозвука» рассказал о выборе размеров коробок и дал рекомендации по предотвращению ошибок при изготовлении сабов.

Выбор вида сабвуфера

Прежде чем устанавливать саб для акустической системы в авто, надо определиться с его видом. На сегодня различается два тип устройств — активные и пассивные. Первые оборудуются встроенной системой звукоусиливающего тракта, а также обладают возможностью регулировки баланса частот — эквалайзером. Благодаря использованию усилительного устройства такие сабвуферы не нуждаются в мощностных характеристиках штатной аудиосистемы. Динамик самостоятельно раскачает колонки до нужного значения.

К основным особенностям надо отнести и высокую надежность устройства. Это достигается благодаря заводской компоновки, а также инженерного расчета, присущего для производителей сабов. Если в приоритете приобрести качественное устройство, которое прослужит не один год, то рекомендуется выбрать активный вариант.

Такие сабвуферы обладают недостатками:

  1. В продаже динамики поставляются в готовом виде. Появляются сложности при установке в салоне транспортного средства. На практике это более характерно для оборудования, выполненного в универсальном корпусе. Его хоть и можно установить практически в любое место, но потребителю при монтаже придется столкнуться с неудобствами.
  2. Любители качественного звучания могут не оценить работу устройства. При изготовлении производители пытаются добиться нужных размеров, которые подходят для большинства салонов современных авто. Но это делается в ущерб высокой эффективности устройства. На практике материалы, из которых производится корпус, не всегда характеризуются значительным качеством.

Пассивный тип устройств отличается от активного тем, что в нем не реализован встроенный усилитель, а также отсутствует возможность корректирования частотного диапазона. Комплектация такого сабвуфера включает в себя только колонку и корпус, в который она устанавливается. Но и качество исполнения последнего не будет на высшем уровне. Рекомендуется приобрести более мощный динамик.

Отсутствие элементов управления рассматривается, как достоинство для проигрывания треков. Поскольку нет искажений, которые может добавить дополнительная электроника, точных результатов позволит добиться подстройка звуковых характеристик.

Канал «Sundown Russia» подробно сравнил все характеристики, преимущества и недостатки акустических приспособлений открытого и закрытого типа.

Особенности размещения

Активный тип устройств располагается почти в любом месте. Но от расположения пассивного сабвуфера зависит качество воспроизводимого баса и музыки в целом.

Допускается несколько мест для монтажа динамиков, они описаны в таблице.

УстановкаОсобенности
В центральной части салона, впередиЭтот вариант оптимальный, если требуется связать устройство с фронтальными колонками. Такое место монтажа позволит обеспечить высокий уровень воспроизведения аудиофайлов. Но в большинстве современных машин свободного пространства впереди для установки сабвуфера нет. Такой вариант более актуален для внедорожников или микроавтобусов
В багажном отсеке, направив сам динамик впередТакой способ установки популярен среди наших соотечественников. Он подходит для всех типов автомобилей
В багажном отделении, но направив колонку назадХороший вариант для машин, выполненных в кузове хэтчбек. Благодаря данному типу расположения звуковая волна при воспроизведении не будет встречать препятствия на пути. Установка саба в багажном отсеке назад не подойдет для транспортных средств, выполненных в кузове купе или седан. В результате звук деформируется, что связано со спецификой конструкции отделения
Под сиденье, на полу автомобиляНеплохой вариант, если надо спрятать устройство, но востребованностью среди автовладельцев не пользуется. Сам саб располагается на одном уровне с полом. А в результате установки под креслом звуковые волны встречают различные преграды на пути
На задней полке в салоне автомобиляТакой вариант размещения оптимально подойдет для всех транспортных средств, независимо от кузова. Основное условие для этого — полка должна быть широкой и прочной. Так она сможет выдерживать низкочастотные басы и не искажать качество звука

Выбирая место для монтажа сабвуфера, нужно произвести точный расчет, это позволит понять, насколько безопасной будет энергия низких частот для окружающих приспособлений. Это важно, поскольку резонанс от короба устройства нанесет повреждения не только месту монтажа, но и другим элементам кузова, например, стеклам.

Проектирование коробки

Чтобы сделать компактный саб, надо рассчитать объем корпуса, а также выбрать материал, из которого он изготовляется. При разработке допускается использование готовых чертежей и схем, взятых с интернета.

Канал «Школа Автозвука Сергея Туманова» подробно рассказал о проектировании коробок для автомобильных акустических устройств.

Как рассчитать литраж корпуса

Объем коробки считается основной характеристикой, которая определяет качество звучания колонок в сабе. Для расчета этого показателя можно воспользоваться двумя методами — с применением специального программного обеспечения либо вручную. В качестве утилит применяется ПО Winisd либо JBL SpeakerShop. Такой софт позволит определить оптимальные размеры устройства и объем корпуса для конкретной модели транспортного средства. Также программы смогут произвести расчет габаритов всех компонентов, которые используются для сборки, с учетом этих данных производится изготовление устройства.

Для вычисления объема корпуса надо воспользоваться формулой V=H*L*A, описание основных значений:

  • H — высота коробки для динамика;
  • L — длина корпуса;
  • А — высота самой колонки.

Из чего изготовить короб

Корпус устройства должен соответствовать динамическим законам акустики, это обеспечит максимально насыщенный и четкий звук. Для производства различных видов коробов понадобятся разные материалы. Чтобы устройство обеспечивало плотное звучание и позволило его изолировать, можно использовать ДСП либо многослойную фанеру. К основным достоинствам таких материалов относится доступная стоимость, а также простота обработки. ДСП и фанера прочны и позволяют сделать качественную изоляцию.

Толщина материала для производства короба сабвуфера составит 3 см.

Как сделать саб своими руками?

Для сборки самодельного акустического устройства перед изготовлением надо определиться с типом корпуса. Существует несколько вариантов видов коробок.

Закрытый ящик

Чертеж для создания закрытого корпуса сабвуфера

Для изготовления короба потребуется ДСП, толщина материала составит 2,3 см, а для боковых стенок понадобятся доски по 2 см.

Процесс изготовления:

  1. Из дерева с помощью лобзика выпиливаются поверхности в соответствии с размерами, рассчитанными заранее по чертежу.
  2. Выполняется сборка корпуса. Для фиксации составляющих элементов допускается применение суперклея, но следует воспользоваться саморезами.
  3. В стенках с помощью дрели делаются отверстия диаметром 3 мм. Для установки головок рекомендуется использовать сверло на 1 см.
  4. Затем на боковой стенке с помощью циркуля делается разметка для установки динамика. Все отверстия вырезаются посредством электролобзика.
  5. При функционировании динамик издает лишние частоты. Чтобы не допустить этого, сам терминал рекомендуется заэкранировать с помощью небольшой коробки. Место соединения обрабатывается клеем. Устройство фиксируется посредством саморезов.
  6. Используя рубанок, удаляются лишние выступы на коробке.
  7. Аналогично на передней части выполняется разметка, делается отверстие для установки колонки. Чтобы короб был защищен от воздействия влаги, его рекомендуется обработать нитролаком. Это средство наносится на внутреннюю часть передней панели.
  8. Для обеспечения более высокой практичности короб оклеивается карпетом. Фиксация этого материала осуществляется с использованием нитролака.
  9. На завершающем этапе колонка устанавливается на акустическом терминале и прикрепляется к коробу.

Фазоинвертор

Чтобы собрать корпус, потребуется:

  • слой шумоизоляционного материала;
  • саморезы для работы с деревом, их диаметр — 5 см;
  • дрель с набором сверел;
  • отвертка с крестовым наконечником;
  • электролобзик;
  • жидкие гвозди;
  • клей герметик и ПВА;
  • карпет;
  • фанера или ДСП толщиной 3 см, чтобы сделать максимально прочный короб и предотвратить пропускание звуковых волн.
Графический чертеж для изготовления корпуса саба с фазоинверторным устройством

Процедура разработки выполняется так:

  1. Производится подготовка составляющих частей корпуса. Из фанеры или ДСП вырезаются передние и задние, а также боковые стенки. Надо сделать верхнюю часть и дно. Для этого используются расчеты и параметры в соответствии с определенным чертежом.
  2. С учетом размеров колонки прорезается отверстие в передней части будущего короба.
  3. Над ним также надо сделать щель для установки трубки фазоинвертора. Затем выполняется фиксация отсека к отверстию для устройства.
  4. Друг с другом склеиваются боковые части корпуса. Это делается, когда оба отверстия готовы. Затем стенки фиксируются друг к другу с помощью саморезов. Каждый элемент крепления требуется закрутить до конца. Нельзя допустить появления пустых пространств между стенками, поскольку это приведет к искажению качества звука сабвуфера.
  5. На задней поверхности короба выполняется вырезка отверстия, через которое прокладываются проводники.
  6. Прежде чем осуществлять соединение составляющих частей корпуса, производится установка колонки.
  7. Затем выполняется внутренняя отделка короба. Используя клей герметик либо смолу, производится обработка всех мест стыков и щелей, если они имеются, чтобы увеличить герметизацию. После того как материал высохнет, внутренняя часть короба обтягивается щумоизоляционной тканью.
  8. По завершении работ отделки корпуса аналогичные действия выполняются с его внешней частью. Собранный короб требуется обтянуть карпетом или похожим материалом. Важно, чтобы ткань полностью закрывала все места стыков, а также отверстие для фазоинвертора. Для фиксации материала используется эпоксидная смола или степлер.

Бандпасс 4-го порядка

При создании такого короба можно ошибиться в расчетах, его изготовлением лучше заниматься автовладельцам, имеющим опыт в этом. Для конструирования модели корпуса рекомендуется воспользоваться специальным программным обеспечением. Непосредственно процедура сборки выполняется так же, как в описанных выше инструкциях.

Схематическое устройство корпуса бандпасса сабвуфера

Но надо учитывать нюансы:

  1. Перегородка, в которую монтируется колонка, выполняется из двух листов фанеры либо ДСП.
  2. Внутренняя часть корпуса обрабатывается шумоизоляционным материалом. Допускается использование ватина.
  3. Сам клей требуется наносить штрихами по всему периметру. Не нужно его использовать много, поскольку это приведет к появлению статических характеристик.
  4. Допускается дополнительная фиксация устройства с помощью строительного степлера.
  5. Пайка проводников выполняется к колонке и к клеммным контактам.
  6. Заднюю часть короба надо максимально загерметизировать. Достичь этого можно благодаря использованию скотча и жидких гвоздей, первый клеится сверху шва.
  7. Чтобы сделать раструб фазоинверторного устройства, производится прогрев краев. Для этого применяются банки.
  8. Для создания отверстия в крышке используется лобзик. В него требуется установить карпет с фазоинверторным устройством.
  9. Обработка мест соединений выполняется с использованием жидких гвоздей.
  10. Задняя часть крышки с фазоинверторным устройством обрабатывается шумоизоляцией. Когда фиксация элементов корпуса завершена, его требуется обклеить карпетом.

БП6

Вариант изготовления сабвуфера БП6 является сложным в плане сборки и проведения расчетов.

Графический рисунок для создания корпуса саба БП6

Он позволяет выдавать качественный звук, как бадпасс четвертого порядка, но частотный диапазон выше. Коэффициент полезного действия устройства, а также мощностные параметры вычисляются с использованием программного обеспечения. Все характеристики подбираются в соответствии с предпочтениями автовладельца. В целом конструкция короба сложнее по сравнению с закрытым ящиком и фазоинвертором.

Особенности сборки устройства:

  1. Для создания более прочных соединений их рекомендуется сделать из деревянных брусков, которые фиксируются саморезами.
  2. Все компоненты короба надо вырезать с учетом размеров. Для изготовления используется фанера или ДСП.
  3. Процедура сборки выполняется по аналогичной технологии. Но вместо обычной шумоизоляции, применяется вата.

Сабвуфер «Стелс»

Для изготовления корпуса такого типа потребуется:

  • сама колонка;
  • решетка для динамика;
  • специальная розетка для подсоединения устройства;
  • комплект кабелей необходимой длины;
  • материал, из которого производится корпус — фанера либо ДСП, его толщина составит 2 см;
  • плита ДВП;
  • эпоксидная смола или клей;
  • лист стекловолокна;
  • кисть;
  • малярный скотч;
  • полиэтилен;
  • саморезы для работы с деревом длиной 4 см;
  • лобзик;
  • дрель с комплектом сверел.

Перед изготовлением короба надо определиться с местом установки саба. Из багажного отделения требуется убрать все инструменты и вещи, чтобы полностью его освободить. Затем выполняется демонтаж обшивки в отсеке. Ее надо осторожно удалить в месте, где устанавливается сабвуфер.

Простая схема с размерами для создания акустического устройства типа Стелс

Процедура изготовления выполняется так:

  1. В месте, куда монтируется музыкальный девайс, надо проложить полиэтиленовую пленку. Ее наличие позволит защитить багажное отделение от клея и грязи.
  2. Место монтажа сабвуфера проклеивается с помощью малярного скотча, для этого рекомендуется использовать не мене двух слоев.
  3. Затем сверху производится укладка кусков стеклоткани. Заранее материал обрабатывается эпоксидной смолой или клеем. Стеклоткань рекомендуется приклеивать внахлест. При выполнении задачи важно сделать так, чтобы стыки были не виды. Не допускается наличие разрывов.
  4. Стеклоткань наклеивается в несколько слоев, не менее пяти. Надо добиться, чтобы общая толщина материала составила 1 см.
  5. Сам короб для акустического устройства твердеет около пятнадцати часов. Когда корпус полностью высохнет, продолжается работа.
  6. Из ДСП либо фанеры вырезается нижняя часть коробки, которая используется в качестве дна. Она фиксируется на корпусе будущего устройства. Для крепления допускается применение герметика либо эпоксидного клея, чтобы предотвратить появление негерметичных швов на корпусе.
  7. На коробе устройства останутся лишние детали, их надо удалить с помощью канцелярского ножа. Так уберутся остатки клея и стекловолокна.
  8. Из ДСП вырезаются боковые стенки устройства, а также его крышка. Округлую часть короба рекомендуется сделать из фанеры. Материал требуется заблаговременно намочить водой, затем сформировать и надежно зафиксировать.
  9. Все составляющие элементы из ДСП качественно проклеиваются эпоксидной смолой либо клеем герметиком. Затем их надо скрепить друг с другом, для этого используют саморезы.
  10. На передней части короба делается отверстие, куда монтируется акустическая колонка.
  11. С помощью дрели сзади или на боковой стенке надо просверлить небольшую щель. Через нее прокладываются кабели из сабвуфера для подключения.
  12. В короб устройства монтируется колонка. Ее фиксация осуществляется посредством саморезов либо клея, можно использовать оба варианта. После сборки все составляющие саба устанавливаются.
  13. На последнем этапе производится покраска акустического устройства либо обтяжка карпетом. Если использовать лак или краску, то все поверхности надо заранее зашлифовать. Быстрее и проще обклеить короб карпетом. Для фиксации материала используется клей или степлер со скобами.

Установка и подключение

При подсоединении устройства к акустической системе надо подготовить:

  • комплект кабелей — три проводника идет в одной обмотке для подключения питания, к автомагнитоле, а также аккумуляторной батарее;
  • предохранительный элемент;
  • конденсаторное устройство;
  • изолента или термотрубки;
  • кусачки;
  • пластмассовые хомуты;
  • набор гаечных ключей.
Карта подсоединения кабелей сабвуфера

Для подключения проводников используется такая схема:

  1. Кабель от саба идет на усилительное устройство. Если это приспособление расположено в салоне, то требуется произвести укладку проводников через технологические отверстия в багажном отсеке. Чтобы скрыть кабели, их прокладывают под пластиковой облицовкой. Для этого декоративные накладки снимаются с помощью отвертки, выкручиваются саморезы. Нельзя прокладывать провода в районе движущихся частей кузова, чтобы не допустить их повреждения.
  2. Затем от усилителя кабель идет на магнитолу. Выход для подключения располагается на задней части аудиоустройства. Автомагнитолу придется демонтировать, а также снять центральную консоль.
  3. Положительный проводник питания при прокладке надо защитить от повреждений. Для этого его рекомендуется завернуть в гофру.
  4. На положительном проводнике устанавливается предохранительное устройство. Его важно разместить ближе к аккумуляторной батарее.

Меры безопасности

Нюансы, которые надо учитывать при установке и подключении устройства:

  1. Не допускается применение нерабочего инструмента или приспособлений, функционирующих со сбоями.
  2. Работая с колющими и режущими предметами, надо соблюдать технику безопасности. Провода на электроинструментах не должны иметь повреждений. Вилка от дрели или электролобзика устанавливается в розетку легко и мягко.
  3. Перед выполнением задачи надо удостовериться в том, что АКБ автомобиля отключена. Это позволит предотвратить поломки в акустической системе.

Фотогалерея

Фото самодельных сабов.

Видео «Пример изготовления сабвуфера из старых динамиков»

Канал «AVTO CLASS» привел образец самостоятельного создания акустического устройства и перемотки колонок, выпущенных при СССР.

 Загрузка …

Самодельные инструменты для полировки и полировки

Самодельные инструменты для полировки и полировки Категория самодельных инструментов для полировки и полировки на сайте
HomemadeTools.net — идеальное место, чтобы найти множество различных инструментов для самостоятельной работы для полировки и полировки, а также полировальные круги, тумблеры, полировальные машины для колес и многие другие приспособления для полировки и полировки, установки, подставки, детали. , и аксессуары.

Если вы хотите создать свой собственный полный буфер / полировщик, ознакомьтесь с нашими сборками преобразований буфера сверла, буферов шпинделя, буферов / шлифовальных машин, преобразователей буфера в измельчитель, переносных буферов, буферов для газовых двигателей, настольных полировщиков и машины для снятия заусенцев.

Если вам нужно создать буфер или полировщик для конкретного применения, у нас также есть различные списки специализированных буферов и полировальных средств, сделанных своими руками, таких как полировщики для плит, полировщики для часов, полировщики для моделистов, полировщики кожевников, полировщики для обуви, полировщики для коленчатого вала, огранка машины, машины для полировки бильярдных шаров и полировальные машины для оптических дисков. Если вы собираетесь построить полную полировку или полировку, вы можете даже построить целые станции и системы полировки, мини-буферы, буферные стойки и даже буферы, сделанные из компонентов беговой дорожки.

Хотите создать свой собственный полировальный круг? У нас есть отличные идеи для сборки полировальных швабр, оправок для полировальных кругов, оправок для полировальных подушек, а также полировальных или полировальных кругов в комплекте. Для полировальных работ меньшего размера у нас есть различные проекты, перечисленные для полировальных коронок и полировальных дисков Dremel.

Хотите отполировать колеса вашего автомобиля или грузовика? Ознакомьтесь с различными типами конструкций, которые мы перечислили для приспособлений для полировки колес и роликов для идеально отполированного колеса.

Возможно, вас заинтересует постройка стакана дома. Если это так, ознакомьтесь с нашими различными сборками для самостоятельного изготовления каменных барабанов и деталей, латунных барабанов, мокрых барабанов, вращающихся барабанов, вибрационных барабанов, орбитальных барабанов, а также станков и машин для удаления заусенцев.

В дополнение ко всем нашим сборкам буферов и полировальных машин, вы можете создать множество различных видов приспособлений, приспособлений и принадлежностей для существующих буферов или полировальных машин. У нас есть идеи для ленточных полировальных приспособлений, приспособлений для полировки труб, установок для полировки рамы и рабочих центров для сверлильных станков для полировки.Вы также можете найти сборки для притирочных станков, полировальных станков, выхлопных труб полировальных машин, инструменты для полировки ладов, инструменты для полировки отверстий, а также инструменты для полировки и полировки узких углов.

Если вы хотите построить целую станцию ​​для полировки и полировки, специальный полировальный инструмент, собственные полировальные или полировальные круги или специальный зажим для полировки и полировки, вы найдете здесь множество различных умных и экономичных идей. на HomemadeTools.net.

Интерфейс буфера DIY | вершинные эффекты.com

Метод

с четырьмя кабелями идеально подходит для системы педалборда MONO, где все искажения, овердрайв и

другие «сухие» эффекты работают перед предусилителем усилителя, в то время как «мокрые» эффекты (например, реверберация

и задержка) проходят между предусилителем и усилителем мощности в контуре эффектов усилителя (посыл / возврат).

Wet / Dry также идеально подходит для системы педалборда MONO, где все искажения, овердрайв и прочее

Перед предусилителем усилителя работает

«сухих» эффектов.Однако «мокрые» эффекты (вроде задержки и реверберации)

подаются через линейный выход (выход линейного уровня, отводимый от выходного трансформатора, проложен до линейного уровня)

, которые обеспечивают «мокрый» эффект (установлен на 100% влажный / убивающий сухой), подключенный к параллельному микшеру. Затем миксер подает

либо A) усилитель мощности, который питает «мокрый» кабинет динамика, либо B) имитатор кабинета / динамика, который питает

балансный выход на DAW или FOH, или C) напрямую питает DAW или FOH (некоторые педали и реечное оборудование

может подавать симметричный выход через XLR / TRS непосредственно из самого устройства на интерфейс или микшер).

* ПРИМЕЧАНИЕ: Для влажных / сухих систем требуется линейный выход и параллельный миксер для вашего «мокрого» FX. Для линейного выхода мы рекомендуем Bray LO-1. В некоторых случаях вам может потребоваться гальваническая изоляция для вашего линейного выхода, для этого мы рекомендуем Suhr ISO Line Out Box. Для параллельного микшеры мы рекомендуем Musicom Lab Parallelizer для одновременного микширования до трех устройств с мокрыми эффектами, он также включает в себя контроль сухого микширования.

Пример применения № 1, СПОСОБ ЧЕТЫРЕ КАБЕЛЯ (4 СМ)

для использования с усилителем с петлей FX

Пример применения № 2, ВЛАЖНЫЙ / СУХОЙ

для использования с линейным выходом, параллельным микшером (FX установлен на 100% влажный / сухой), сухим усилителем и кабиной динамика, а также усилителем мощности и кабиной для влажных динамиков

Пример приложения № 3, все FX В СЕРИИ

для использования со всеми FX последовательно перед усилителем, когда вы не можете использовать 4CM или W / D, просто используйте гнездо «return» в качестве «выходного» гнезда.

и все эффекты в петле fx или w / d будут последовательно перенаправлены после всех сухих эффектов — теперь все педали будут упираться в переднюю часть усилителя

Шаблон для сверления (корпус Hammond 1590B)

Спецификация материалов:

1x Hammond 1590B Корпус:

3x буферная печатная плата Creation Audio Labs (выберите 1 мегом, нейлоновый разъем ISO, единичное усиление):

4x Neutrik NRJ6HF 1/4 «TRS jack (s):

4x Neutrik NRJ 1/4 «Гайка (и):

1x Шунтирующий разъем для наконечника Switchcraft 1/4 «Гнездо (и):

1x разъем питания постоянного тока:

Заглушки для отверстий для трапецеидальных искажений 0x:

1x Монтажный провод:



STEREO TRI BUFFER + TUNER OUT

Stereo Tri Buffer идеально подходит для любой системы педалборда STEREO, работающей перед двумя усилителями.

Выход тюнера обеспечивает буферизованную подачу на ваш тюнер и позволяет удалить тюнер из
. ваш путь прохождения сигнала, получая при этом прямой поток с вашего входа. Его также можно использовать как
прямой или чистый (незатронутый) выход для повторного усиления гитары.

* ПРИМЕЧАНИЕ. Для некоторых схем с несколькими усилителями может потребоваться гальваническая развязка и / или изменение полярности на одном усилителе. Мы предлагаем Lehle P Разделение как решение, размещенное как можно ближе к усилителю для развязки трансформатора и регуляторов полярности (фазы).

Пример применения, СТЕРЕО УСИЛИТЕЛИ + ТЮНЕРНЫЙ ВЫХОД

для использования с двумя усилителями, стерео L и R, с буферизованным питанием тюнера от выхода тюнера — выход тюнера также может использоваться как «сухой» для повторного усиления

Шаблон для сверления (корпус Hammond 1590B)

Схема подключения (показана изнутри корпуса)

Спецификация материалов:

1x Hammond 1590B Корпус:

3x буферная печатная плата Creation Audio Labs (выберите 1 мегом, нейлоновый разъем ISO, единичное усиление):

Как приготовить буферный раствор Трис для медицинского или лабораторного использования

Буферные растворы — это жидкости на водной основе, которые содержат как слабую кислоту, так и сопряженное с ней основание.Благодаря своему химическому составу буферные растворы могут поддерживать pH (кислотность) на почти постоянном уровне, даже когда происходят химические изменения. Буферные системы встречаются в природе, но они также чрезвычайно полезны в химии.

Использование буферных растворов

В органических системах природные буферные растворы поддерживают постоянный уровень pH, что позволяет протекать биохимическим реакциям без вреда для организма. Когда биологи изучают биологические процессы, они должны поддерживать постоянный уровень pH; для этого они использовали подготовленные буферные растворы.Буферные растворы были впервые описаны в 1966 г .; многие из тех же буферов используются сегодня.

Чтобы быть полезными, биологические буферы должны соответствовать нескольким критериям. В частности, они должны быть водорастворимыми, но не растворимыми в органических растворителях. Они не должны проходить через клеточные мембраны. Кроме того, они должны быть нетоксичными, инертными и стабильными на протяжении всех экспериментов, в которых они используются.

Буферные растворы естественным образом присутствуют в плазме крови, поэтому в крови поддерживается постоянный pH в пределах 7.35 и 7,45. Буферные растворы также используются в:

  • процессы ферментации
  • крашение тканей
  • химический анализ
  • калибровка pH-метров
  • Экстракция ДНК

Что такое буферный раствор Трис?

Трис — это сокращение от трис (гидроксиметил) аминометана, химического соединения, которое часто используется в физиологическом растворе, поскольку оно изотонично и нетоксично. Поскольку у него есть трис, pKa 8,1 и уровень pH от 7 до 9, буферные растворы триса также широко используются в ряде химических анализов и процедур, включая экстракцию ДНК.Важно знать, что pH в трис-буферном растворе действительно изменяется с температурой раствора.

Эмельдир / Wikimedia Commons / CC0 1.0

Как приготовить Трис-буфер

Легко найти коммерчески доступный раствор трис-буфера, но его можно приготовить самостоятельно, используя соответствующее оборудование.

Материалы :

Рассчитайте количество каждого элемента, который вам нужен, исходя из молярной концентрации раствора, который вам нужен, и количества необходимого буфера.

  • трис (гидроксиметил) аминометан
  • вода деионизированная дистиллированная
  • HCl

Процедура:

  1. Начните с определения того, какую концентрацию (молярность) и объем трис-буфера вы хотите приготовить. Например, буферный раствор Трис, используемый для физиологического раствора, варьируется от 10 до 100 мМ. После того, как вы определились с тем, что вы делаете, рассчитайте необходимое количество молей Триса, умножив молярную концентрацию буфера на объем создаваемого буфера.( моль Трис = моль / л x л)
  2. Затем определите, сколько это граммов Триса, умножив количество молей на молекулярную массу Триса (121,14 г / моль). грамм Триса = (моль) x (121,14 г / моль)
  3. Растворите Трис в дистиллированной деионизированной воде, от 1/3 до 1/2 желаемого конечного объема.
  4. Смешайте с HCl (например, 1M HCl) до тех пор, пока pH-метр не покажет вам желаемый pH для вашего буферного раствора Tris.
  5. Разбавьте буфер водой до достижения желаемого конечного объема раствора.

После приготовления раствора его можно хранить в течение нескольких месяцев в стерильном помещении при комнатной температуре. Длительный срок хранения буферного раствора Трис возможен, поскольку раствор не содержит белков.

границ | Самодельный экономичный буфер для консервации — лучшая альтернатива коммерческим методам консервации для исследования микробиома

Введение

Последние достижения в области высокопроизводительного секвенирования, вычислительных методов и новых инструментов биоинформатики значительно расширили наши знания о полезной роли симбиотических кишечных микробов в питании хозяина, иммунной системе и социальных взаимодействиях, а также о негативных последствиях нарушений микробиома, способствующих развитию человека. болезни (Kau et al., 2011; Чо и Блазер, 2012; Althani et al., 2016; O’Doherty et al., 2016). В последнее время эта быстрорастущая область исследований распространилась на диких животных, о микробиомах кишечника которых известно относительно мало. Действительно, исследования микробиома кишечника немодельных видов, для которых ранее не хватало такой информации, становятся все более популярными и подчеркивают важные аспекты, касающиеся здоровья и сохранения животных (Bahrndorff et al., 2016; Stumpf et al., 2016).

Обычно микробиомы кишечника изучаются путем секвенирования филогенетически важных фрагментов гена рибосомной РНК 16S, амплифицированных из фекальных ДНК-изолятов, с использованием единственной комбинации праймеров.Поскольку эти праймеры амплифицируются среди бактериальных таксонов, этот простой и экономичный подход обеспечивает идеальные наборы данных для анализа микробного сообщества (Soergel et al., 2012). После первоначальной качественной фильтрации полученные считывания группируются в соответствии с порогом сходства, сравниваются с бактериальными базами данных для присвоения таксономии (DeSantis et al., 2006; Quast et al., 2013) и вместе с информацией о численности на одного человека. бактериальный таксон, записываются в так называемую таблицу операционных таксономических единиц (OTU).Впоследствии исследуется влияние внутренних или внешних факторов на микробное сообщество и соответствующие меры разнообразия. Поскольку многие из этих мер включают информацию о бактериальном разнообразии, филогении и численности по таксону, изменения в бактериальных сообществах, связанные с ненадлежащим хранением исходного образца фекалий, будут искажать результаты и последующие биологические выводы.

Оптимальной отправной точкой для таких исследований микробиома кишечника является достаточное количество свежего незагрязненного образца фекалий, из которого немедленно выделяется ДНК.Если это невозможно, то свежие образцы следует немедленно заморозить до проведения лабораторных анализов (Wu et al., 2010; Choo et al., 2015; Fouhy et al., 2015; Hale et al., 2015). Замораживание образцов подавляет рост бактерий, и ингибиторы не препятствуют выделению ДНК и амплификации генов-мишеней, как в случае некоторых сред для консервации (Nechvatal et al., 2008). Однако это часто невозможно в полевых условиях, особенно в исследовательских проектах по отбору проб дикой природы в отдаленных районах, в которых нет ни морозильных установок, ни жидкого азота (LQN).

В настоящее время доступно несколько консервационных сред, обещающих сохранение характеристик образца с момента сбора фекалий до выделения ДНК и еще более чувствительной РНК. DNA / RNA Shield ™ и RNA later ® часто используются в качестве консервационной среды для сохранения ДНК и РНК в различных типах образцов. Из-за их стоимости также часто используются более дешевые альтернативы, такие как сушка на воздухе определенных тампонов или использование этанола (Guo et al., 2016). Последний, однако, имеет недостатки, так как его характеризует как «опасный груз», что вызывает ограничения при международных перевозках на самолете. В других исследованиях исследовательские группы разработали свою собственную формулу для среды для сохранения, такой как самодельный буфер для сохранения нуклеиновых кислот (NAP) (Camacho-Sanchez et al., 2013).

Здесь мы использовали стерильные мазки для взятия образцов фекалий 11 овец и обрабатывали образцы в соответствии с различными методами консервирования в течение 10 дней до выделения ДНК: (1) мазки для судебно-медицинской экспертизы (замороженные / не замороженные), (2) NAP (замороженные / не заморожен), (3) ДНК / РНК Shield ™ (заморожен / не заморожен) и (4) РНК позже ® (заморожен / не заморожен).Тампоны — чрезвычайно практичный инструмент для отбора проб бактерий, поскольку они стерильны, могут легко храниться в пробирках Эппендорфа объемом 2 мл и, что наиболее важно, не причиняют вреда хозяевам. Тем не менее, исследование микробиомов кишечника на основе образцов фекальных мазков, которые обычно имеют небольшое количество образцов, может потребовать хорошей консервационной обработки, поскольку микробные сообщества могут быстро отличаться от своего исходного состояния из-за сильного воздействия атмосферного кислорода на бактериальное сообщество ( Menke et al., 2015; Теджо и др., 2015). Мы рассматривали обработку «судебно-медицинские мазки / замороженные» в качестве контрольной обработки, поскольку это была бы предпочтительная консервативная обработка при отсутствии ограничений, связанных с полевыми условиями и ограничениями на транспортировку. Мы исследовали, влияет ли консервативная обработка на характеристики микробных сообществ кишечника овец и их альфа- и бета-разнообразие, а также оценили согласованность результатов секвенирования на основе повторных образцов в рамках консервативных обработок.Насколько нам известно, это единственное исследование, в котором изучалось влияние консервирующих сред в сочетании с замораживанием / незамораживанием на образцы кишечного микробиома как от нескольких человек, так и в повторностях внутри отдельного человека.

Методы

Обработка образцов кала

Мы собрали пробы фекалий 11 овец ( Ovis aries sp.), Содержащихся на частном лугу в Баден-Вюртемберге, Германия. Образцы кала сразу же тщательно перемешивали в пластиковом пакете для получения однородного образца кала.Чтобы оценить влияние различных методов консервации (мазки для судебно-медицинской экспертизы, буфер NAP, DNA / RNA Shield ™ и RNA later ® ) и условий хранения (комнатная температура, замораживание), мы взяли по восемь мазков из каждого образца фекалий. Два мазка для судебно-медицинской экспертизы (Sarstedt, Nuembrecht, Германия) помещали в 2 мл пробирки Eppendorf без консервирующей среды. Один сразу замораживали при -20 ° C, а другой хранили при комнатной температуре. Тампоны для судебной экспертизы имеют вентиляционную мембрану, которая обеспечивает процесс высыхания на воздухе, одновременно защищая от загрязнения.Кроме того, было взято шесть образцов фекалий с помощью FLOQSwabs ™ (Copan Flock Technologies, Брешиа, Италия). Два из них были сохранены в 2-миллилитровых пробирках Эппендорфа, содержащих 600 мкл домашней среды NAP (NAP; Camacho-Sanchez et al., 2013), два были сохранены в 600 мкл РНК позже ® и два были сохранены в 600 мкл ДНК / РНК Shield ™ (Zymo Research, Фрайбург, Германия). Свабы FLOQSwab сконструированы таким образом, что они высвобождают весь образец в консервирующую среду. После каждой консервативной обработки одну пробирку, содержащую тампон, замораживали при -20 ° C после инкубации с буфером в течение 4 часов, тогда как второй тампон хранили в буфере для консервации при комнатной температуре.ДНК экстрагировали из всех образцов после 10 дней хранения в соответствующих условиях хранения. Мы рассматривали судебно-медицинский мазок / замороженное лечение в качестве контрольного лечения для всех последующих анализов.

Чтобы исследовать консистенцию внутри образца и, таким образом, эффект консервационного буфера независимо от различий между особями, мы взяли 41 мазок для одной из 11 овец (особь R ). Из них пять мазков для судебно-медицинской экспертизы были высушены на воздухе (мазки для судебно-медицинской экспертизы / замороженные образцы не были доступны для индивидуального R ), 12 мазков хранились в NAP (6 — при комнатной температуре, 6 — замороженными до экстракции через 10 дней) 12 тампонов в DNA / RNA Shield ™ (6 при комнатной температуре, 6 замороженных) и 12 тампонов в RNA , позже ® (6 при комнатной температуре, 6 замороженных).Наконец, для контроля перекрестного загрязнения мы секвенировали восемь холостых образцов [NAP (3), DNA / RNA Shield ™ (3) или вода (2)], которые случайным образом помещали среди реальных образцов во время экстракции ДНК и полимеразной цепной реакции ( ПЦР) амплификация.

Очистка ДНК микробиома

Консервационная среда, испытанная в этом исследовании, требовала различных обработок перед экстракцией ДНК. Поскольку NAP и РНК позже ® имеют плотность, аналогичную плотности бактериальных клеток, которые были высвобождены из тампона в раствор, трудно повторно осаждать клетки центрифугированием.Кроме того, РНК позже ® может вмешиваться в процесс выделения ДНК (Athanasio et al., 2016). Чтобы удалить NAP и РНК позже ® из наших образцов, мы разбавили их, добавив равные объемы ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS) перед центрифугированием при 6000 g в течение 15 минут, как рекомендовано в руководстве (Life Technologies, 2011) и отбросили супернатант. DNA / RNA Shield ™ имеет более похожую на воду плотность и может использоваться без удаления реагента в большинстве наборов для очистки ДНК; поэтому мы не проводили предварительную обработку этих образцов.Высушенные на воздухе судебно-медицинские тампоны замачивали в 1 мл буфера InhibitEx из набора QIAamp ® Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Осажденный материал (NAP, РНК , позже ® ) и растворенный материал (ДНК / РНК Shield ™) смешивали с 1 мл буфера InhibitEx и гомогенизировали с керамическими шариками в течение 2 × 3 мин на SpeedMill (Analytik Jena, Германия. ). После этого мы следовали протоколу производителя по выделению ДНК из стула для обнаружения патогенов.

ПЦР-амплификация, подготовка библиотеки и высокопроизводительное секвенирование

Выделенную ДНК амплифицировали с универсальными бактериальными праймерами 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3 ‘) и 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) для амплификации фрагмента 291 п.н. гипервариабельной области V4 гена 16S рРНК ( Caporaso et al., 2010, 2011). Поэтому мы следовали схеме маркировки 4-праймерных ампликонов Fluidigm (система Access Array ™ для систем секвенирования Illumina, © Fluidigm Corporation), в которой меченые целевые специфические праймеры (CS1-TS-515F и CS2-TS-806R) были объединены с образцом. -специфические пары праймеров, которые содержат последовательность штрих-кодирования и последовательности адаптера, используемые системами секвенирования Illumina. Мы добавили четыре случайных основания к нашим прямым праймерам, чтобы избежать ошибок во время идентификации кластера из-за высокого сходства оснований для всех ампликонов в циклах идентификации кластера.Мы использовали химию Fluidigm с начальной ПЦР ампликона с последующей второй ПЦР со штрих-кодированием.

Первоначальный объем ПЦР 10 мкл содержал 3-5 нг экстрагированной ДНК, 0,5 единиц ДНК-полимеразы FastStart Taq (Roche Applied Science, Мангейм, Германия), 1х буфер для ПЦР, 4,5 мМ MgCl 2 , 250 мкМ каждый dNTP, 0,5 мкМ праймеры и 5% диметилсульфоксид (ДМСО). ПЦР проводили с этапом активации при 95 ° C в течение 4 минут, затем 30 циклов при 95 ° C в течение 30 секунд, 60 ° C в течение 30 секунд, 72 ° C в течение 45 секунд и окончательной элонгации при 72 ° C в течение 10 минут.Объем ПЦР со штрих-кодированием (20 мкл) содержал 2 мкл исходного продукта ПЦР, 1 единицу ДНК-полимеразы FastStart Taq, 1x буфер для ПЦР, 4,5 мМ MgCl 2 , 200 мкМ каждого dNTP и 80 нМ на праймер штрих-кода. Условия ПЦР были такими же, как и раньше, но было выполнено только 10 циклов. Амплификации количественно оценивали УФ / видимой спектроскопией на Xpose (Trinean, Gentbrugge, Бельгия), и образцы объединяли до эквимолярных количеств ДНК. Библиотека была подготовлена ​​в соответствии с рекомендациями компании Illumina (Miseq Reagent Kit v2 — Руководство по подготовке реагентов) и загружена на 7.17:00 на проточной кювете MiSeq с добавлением 10% PhiX. Секвенирование парных концов выполняли в течение 2 × 251 цикл.

Биоинформатика

Для подготовки чтения для анализа бактериального сообщества в QIIME [версия 1.9.1; (Caporaso et al., 2010)] и phyloseq (McMurdie and Holmes, 2013), мы выполнили следующие шаги, используя параметры по умолчанию, если не указано иное. Мы (а) объединили парные чтения ( multiple_join_paired_ends.py сценарий в QIIME), (б) применили порог качества q = 30 и процент баз, которые должны иметь это качество, с p = 75 [ fastq_quality_filter.py в fastx-toolkit (FASTX-Toolkit)], (c) преобразовал файлы fastq в файлы fasta (сценарий fastq_to_fasta.py в fastx-toolkit) и (d) вырезал праймеры с помощью cutadapt (Martin, 2011) . Затем полученные считывания использовались в качестве отправной точки для дальнейших анализов в QIIME, таких как проверка химер, кластеризация OTU, фильтрация небактериальной ДНК и расчет альфа- и бета-разнообразия. Проверка химеры была проведена с помощью USEARCH (Эдгар и др., 2011) против rep_set / 97_otus.fasta (Greengenes версии 13.5.) (сценарий identify_chimeric_seqs.py ) базы данных Greengenes (http://greengenes.lbl.gov,). Затем мы применили подход с открытой эталонной кластеризацией OTU (сценарий pick_open_reference_otus.py ) с порогом сходства 0,97 также в отношении базы данных Greengenes, снова с помощью USEARCH (usearch61; Edgar, 2010), а таксономия была назначена с помощью RDP. классификатор (Wang et al., 2007). Впоследствии вся небактериальная ДНК была удалена из набора данных ( filter_taxa_from_otu_table.py ) с использованием соответствующих идентификаторов (k_Eukaryota, c_Chloroplast, f_Mitochondria, k_Archaea).

Статистический анализ

Влияние выхода ДНК на результаты секвенирования

Мы проверили влияние консервативной обработки на выход ДНК с помощью обобщенной модели наименьших квадратов (GLS). Переменная ответа представляла собой логарифмически преобразованный выход ДНК плюс один, а объясняющая переменная была консервативной обработкой («судебно-медицинские мазки / заморожены», «судебно-медицинские мазки / не заморожены», «NAP / заморожены», «NAP / не заморожены», «ДНК / РНК. Shield ™ / заморожен »,« ДНК / РНК Shield ™ / не заморожен »,« РНК позже ® / заморожен »или« РНК позже ® / не заморожен »).Неоднородность между консервационными обработками контролировалась (Zuur et al., 2009). Мы исследовали, различалась ли глубина секвенирования в зависимости от выхода ДНК и консервативной обработки, с использованием линейной модели смешанных эффектов (LMM) (Zuur et al., 2009; Pinheiro et al., 2016). Переменная ответа представляла собой логарифмически преобразованное число последовательностей, а независимыми переменными были консервативная обработка и выход ДНК. Были масштабированы как переменная ответа, так и выход ДНК. (т.е. каждое значение вычиталось из среднего значения совокупности и делилось на стандартное отклонение совокупности).Случайным фактором была идентичность овцы. Выбор модели был достигнут посредством выбора модели, основанной на теории информации (I – T) (Burnham et al., 2002). Все возможные модели-кандидаты были построены с использованием переменных-предикторов, описанных выше. Информационный критерий Акаике, скорректированный с учетом малых размеров выборки (AICc), и веса AICc (ω) использовались для оценки относительной силы поддержки моделей (Burnham et al., 2002; Johnson and Omland, 2004).

Влияние консервативных обработок на измерения альфа-разнообразия

Чтобы изучить влияние консервативных обработок на долю ОТЕ, принадлежащих к пяти наиболее распространенным типам ( Firmicutes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Proteobacteria, Spirochaetes ), и долю ОТЕ, принадлежащих к остальным типам, мы использовали обобщенную линейную смешанную модель (GLMM) с биномиальным распределением с использованием пакета lme4 в R (Bates et al., 2015). Мы включили консервативную обработку («судебно-медицинские мазки / замороженные», «судебно-медицинские мазки / не замороженные», «NAP / замороженные», «NAP / незамороженные», «DNA / RNA Shield ™ / замороженные», «DNA / RNA Shield ™ / не заморожен »,« РНК позже ® / заморожен »или« РНК позже ® / не заморожен ») в качестве объясняющей переменной. Случайным фактором была идентичность овцы. Опять же, выбор модели был достигнут посредством выбора теоретико-информационной (I – T) модели (Burnham et al., 2002). Информационный критерий Акаике, скорректированный для малых размеров выборки (AICc), и веса AICc (ω) были использованы для оценки относительной силы поддержки моделей (Burnham et al., 2002; Джонсон и Омланд, 2004 г.). Чтобы оценить относительное отклонение в доле OTU, принадлежащих к типу, между консервативными обработками, мы построили графики оценок параметров моделей GLMM (с контрольной обработкой «судебно-медицинские мазки / замороженные» в качестве точки пересечения). Кроме того, мы оценили отношение шансов размера эффекта (OR; Nakagawa and Cuthill, 2007), чтобы измерить отклонение в доле OTU, принадлежащих к типу в рамках консервативной обработки, по сравнению с контрольной обработкой. Отношение шансов измеряет шансы того, что возникнет ОТЕ, при условии, что образец сохраняется в исследуемой консервативной обработке или в контрольной консервационной обработке ( OR = 1 указывает на отсутствие разницы в шансах между исследованной консервационной обработкой или контрольной обработкой; OR > 1 указывает на увеличение шансов в исследуемой консервативной обработке; а OR <1 указывает на уменьшение шансов в исследованной консервационной обработке).

Чтобы сравнить влияние различных методов консервирования на разнообразие бактерий с учетом глубины секвенирования, мы рассчитали три индекса альфа-разнообразия («наблюдаемые OTU» (т. Е. Просто количество OTU), «разнообразие Шеннона» Spellerberg and Fedor, 2003, и «Филогенетическое разнообразие» (PD, Faith and Baker, 2007) для каждого образца микробиома кишечника Все показатели альфа-разнообразия были масштабированы, чтобы облегчить сравнение эффекта консервативной обработки между показателями альфа-разнообразия.Для статистического тестирования мы использовали общие аддитивные смешанные модели (GAMM) с распределением Гаусса, функцией связи идентичности и оценкой максимального правдоподобия (ML) с помощью пакета «mgcv» в R (Wood, 2006). Консервационная обработка («судебно-медицинские мазки / замороженные», «судебно-медицинские мазки / незамороженные», «NAP / замороженные», «NAP / незамороженные», «DNA / RNA Shield ™ / замороженные», «DNA / RNA Shield ™ / не замороженные»). заморожен »,« РНК позже ® / заморожен »или« РНК позже ® / не заморожен »), а количество последовательностей было введено в качестве независимых переменных.Последний был включен как более сглаживающий член, а максимальная эффективная степень свободы (e.d.f), определяющая степень сглаживания, была ограничена пятью. Идентичность овец использовалась в качестве случайного фактора, и мы контролировали гетерогенность между консервирующей средой и замораживанием (Zuur et al., 2009). Выбор модели был достигнут посредством выбора модели, основанной на теории информации (I – T), как описано выше (Burnham et al., 2002). Также, как указано выше, мы построили оценки параметров моделей GAMM и рассчитали OR в рамках консервативной обработки относительно контрольной обработки (судебно-медицинские мазки / замороженные) в качестве величины эффекта.Отношения шансов можно рассчитать, если независимая переменная является непрерывной; однако в этом случае OR варьируются в зависимости от единиц измерения (Nakagawa and Cuthill, 2007). Поскольку объясняющие переменные были масштабированы, можно сравнить относительный эффект консервативной обработки на альфа-разнообразие между различными показателями, но OR не являются показателем абсолютного эффекта консервационной обработки на отдельные показатели альфа-разнообразия.

Влияние консервантов на бета-разнообразие

Чтобы сравнить влияние различных методов консервирования на бета-разнообразие, мы рассчитали взвешенный и невзвешенный показатель UniFrac (Lozupone and Knight, 2005; Lozupone et al., 2011), который включает информацию о бактериальной филогении, с использованием пакета R «phyloseq.» Мы создали матрицу расстояний, включающую всех людей, и матрицу только с индивидуумом R . Мы протестировали влияние отдельных овец (включая всех особей) и консервативной обработки на взвешенные и невзвешенные матрицы расстояний UniFrac, используя подход PERMANOVA [функция адониса в R-пакете «веганский», (Oksanen et al., 2014)]. Мы использовали как взвешенные, так и невзвешенные показатели UniFrac, чтобы проверить, оказывают ли методы сохранения более сильное влияние на относительную численность, чем на наличие / отсутствие OTU.Выбор модели был достигнут посредством выбора модели, основанной на теории информации (I – T), как описано выше (Burnham et al., 2002). Мы также указываем величину вариации, объясняемую каждой независимой переменной как R 2 , ​​как определено в функции adonis в пакете R «веганский».

Заявление об одобрении этических норм

Овцы из этого исследования принадлежат Рейнхольду Вильгельму. Содержание этих животных одобрено Министерством питания, сельского и лесного хозяйства (AELF) в Вертингене (номер основных данных участка: 097731130105).Образцы были собраны после естественной и добровольной дефекации. Таким образом, для нашего исследования не требуется одобрение этических норм.

Результаты

Взаимосвязь между консервативной обработкой, выходом ДНК и глубиной секвенирования

Выход ДНК

различается в зависимости от консервативной обработки (ΔAICc = 34,21, AICc ω = 1, дополнительная таблица 1, рисунок 1). Образцы, которые были заморожены перед очисткой ДНК, приводили к более высоким концентрациям, чем незамороженные образцы при всех обработках, кроме обработок DNA / RNA Shield ™ (рис. 1).Выбор модели подтвердил отрицательную взаимосвязь между глубиной секвенирования и выходом ДНК (ΔAICc = 7,13, дополнительная таблица 1, дополнительный рисунок 1). Выбор модели также подтвердил различия в глубине секвенирования между консервативными обработками (ΔAICc = 8,44, дополнительный рисунок 1). Однако только «ДНК / РНК Shield ™ / не замороженный» имел значительно более высокую глубину секвенирования по сравнению с контрольной обработкой (дополнительный рисунок 1).

Рис. 1. Различия в выходе ДНК при консервировании.(A) Оценка параметров моделей GLS выхода экстракции ДНК в соответствии с консервативной обработкой. (B) Log (выход ДНК +1) для каждого образца соответствующей консервативной обработки.

Необработанные данные циклов секвенирования

Мы успешно секвенировали бактериальный ген 16S рРНК в 114 из 122 образцов фекалий овец (дополнительные данные 1, дополнительная таблица 2), в результате чего было получено 3 681 449 считываний после слияния считываний парных концов. После того, как были выполнены все биоинформатические шаги, окончательная таблица OTU была построена на 2 575 354 считываниях в диапазоне от 7101 до 185 518 считываний на человека (среднее значение = 22 591, SD = 17 555).Примечательно, что «РНК позже ® / замороженная» была единственной консервативной обработкой, для которой не происходило выпадения при секвенировании. Последовательности, полученные из пустых образцов, содержали только несколько последовательностей (среднее: 504,5, диапазон: 114–1573), в которых преобладали бактериальные типы Proteobacteria и Actinobacteria, скорее всего, из-за бактериального загрязнения, присутствующего в используемых наборах для экстракции (Salter et al. , 2014). Для OTU, обнаруженного в холостых пробах (экстракция и ПЦР-бланки), максимальная доля прочтений в образце овцы составляла 0.04% (и средний максимум для каждой OTU, присутствующей в холостом образце, обнаруженном в образце овцы, составлял 0,00004%; дополнительные данные 2). Поэтому маловероятно, что загрязнение буферами, а также перекрестное загрязнение окажут заметное влияние на результаты проб овец.

Относительная численность бактериального типа

Типы бактерий с наибольшей долей OTU во всех вариантах консервирования были Firmicutes [среднее значение 54,60, 95% ДИ (51,34, 57,12)], Bacteroidetes [среднее значение 33.45, 95% доверительный интервал (31,34, 35,91)], веррукомикробия [среднее значение 3,28, 95% доверительный интервал (2,79, 3,74)], протеобактерии [среднее значение 2,49, 95% доверительный интервал (1,96, 3,22)] и спирохеты [среднее значение 2,04, 95% CI (1.12, 3.10)] (Таблица 1; см. Дополнительные данные 3 для максимально возможного таксономического разрешения). Выбор модели выявил сильную поддержку эффекта консервативных обработок на долю OTU, принадлежащих Firmicutes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Proteobacteria, Spirochaetes и другим менее многочисленным типам (Рисунок 2, Таблица 2).Для трех наиболее распространенных бактериальных типов, которые доминировали в бактериальном сообществе (Firmicutes, Bacteroidetes и Verrucomicrobia), «NAP / замороженный» был консервативной обработкой, которая меньше всего отклонялась от контрольной обработки (Рисунок 2). Действительно, для Firmicutes и Verrucomicrobia 95% доверительные интервалы оценок параметров перекрывали ноль, а OR были близки к 1 для всех трех типов (рис. 2). Консервационная обработка «NAP / замороженный» привела к более высокой доле OTU, принадлежащих типам Proteobacteria и Spirochaetes, и более низкой доле, принадлежащим менее многочисленным типам (рис. 2).Однако в целом отклонение в доле OTU было менее сильным для образцов, сохраненных в «NAP / замороженных», по сравнению с другими видами обработки, исследованными в этом исследовании. Единственной другой консервативной обработкой, которая была сопоставима с «NAP / замороженный», была консервационная обработка «РНК позже ® / замороженная». Доля OTU из доминирующего типа Firmicutes, однако, отклонялась значительно больше, чем при обработке «NAP / замороженный», по сравнению с контролем ( OR = 0.924 относительно ИЛИ = 1,013 для NAP / замороженный; Рисунок 2), а отклонение относительно контроля для Proteobacteria, Spirochaetes и других менее многочисленных типов было намного сильнее (Рисунок 2). Что касается обработок, при которых замораживание не применялось, сохранение, для которого отклонение в доле OTU, принадлежащих к типу, было наименее сильным по сравнению с контролем, было «NAP / не заморожено» со значениями OR в диапазоне от 0,84 до 1,20 (a намного более узкий диапазон, чем у всех других незамороженных обработок, рисунок 2).

Таблица 1. Десять наиболее распространенных бактериальных типов микробиома кишечника барана .

Рис. 2. Оценки параметров (точки), 95% доверительные интервалы (тонкие линии) и стандартное отклонение (толстые линии) от GAMM, моделирующих влияние консервативной обработки на долю ОТЕ, принадлежащих к бактериальным типам Firmicutes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia. , Proteobacteria, Spirochaetes и остальные менее многочисленные филы . Перехват был контрольной обработкой (немедленное замораживание судебно-медицинской экспертизы) образцов.Пунктирная линия представляет собой точку пересечения, а оценка параметра консервативной обработки с 95% доверительными интервалами, которые не перекрывают эту пунктирную линию, представляет собой значительное отклонение от контрольной обработки. Переменная ответа и объясняющая переменная «количество последовательностей» были масштабированы, что позволило провести относительное сравнение эффекта буферов сохранения между показателями альфа-разнообразия (но это означает, что абсолютные значения точки пересечения и количества последовательностей здесь не представлены).Числа над оценками параметров представляют собой отношения шансов, которые представляют отклонение доли OTU, принадлежащих к типу в рамках консервативной обработки, по сравнению с контрольной обработкой (судебно-медицинские мазки / замороженные).

Таблица 2. Выбор модели GLMM доли ОТЕ из филы Firmicutes (A), Bacteroidetes (B), Verrucomicrobia (C), Proteobacteria (D), Spirochaetes (E) и других менее распространенных типов (F) согласно консервационной обработке; показаны количество параметров (K), логарифм правдоподобия (logLik), AICc моделей, изменение AICc по сравнению с моделью с лучшим рейтингом (ΔAICc) и веса модели Акаике (ω) .

Альфа-разнообразие

При контроле глубины секвенирования выбор модели выявил сильную поддержку эффекта консервативной обработки на все три показателя альфа-разнообразия (Таблица 3: a. Наблюдаемые OTU: ΔAICc = 8,13, AICc ω = 0,983, b. Разнообразие Шеннона: ΔAICc = 17,05 , AICc ω = 0,999, c. PD: ΔAICc = 7,47, AICc ω = 0,977).

Таблица 3. Выбор модели GAMM (A) наблюдаемых OTU, (B) разнообразия Шеннона и (C) филогенетического разнообразия (PD) в соответствии с глубиной секвенирования (более гладкий термин) и режимом сохранения; показаны количество параметров (k), логарифм правдоподобия (logLik), AICc моделей, изменение AICc по сравнению с моделью с лучшим рейтингом (ΔAICc) и веса модели Акаике (ω) .

Все показатели альфа-разнообразия для каждой консервативной обработки (Рисунок 3) были ниже, чем альфа-разнообразие контрольной обработки (точка пересечения на Рисунке 3). Только для разнообразия Шеннона «мазки для судебно-медицинской экспертизы / незамороженные» и «ДНК / РНК-щит ™ / замороженные» 95% доверительный интервал оценки перекрывается с нулем (рис. 3). Отрицательный эффект консервативных обработок на альфа-разнообразие по сравнению с «судебно-медицинскими мазками / замороженными» был сильнее для «ДНК / РНК Shield ™ / не замороженный», чем для всех других консервативных обработок (рис. 3).Последнее предполагает, что бактерии в «ДНК / РНК Shield ™ / незамороженные» плохо сохранялись по сравнению со всеми другими методами консервирования. Однако для всех остальных методов консервирования альфа-разнообразие было очень схожим (рис. 3).

Рис. 3. Оценки параметров (точки), 95% доверительные интервалы (тонкие линии) и стандартное отклонение (толстые линии) от GAMM, моделирующих влияние консервативной обработки на наблюдаемые OTU, PD и контроль разнообразия Шеннона для глубины секвенирования .Перехватом была контрольная обработка (мазки для судебной экспертизы / замораживание) образцов. Пунктирная линия представляет собой точку пересечения, а оценка параметра консервативной обработки с 95% доверительными интервалами, которые не перекрывают эту пунктирную линию, представляет собой значительное отклонение от контрольной обработки. Переменная ответа и объясняющая переменная «количество последовательностей» были масштабированы, что позволило провести относительное сравнение эффекта буферов сохранения между показателями альфа-разнообразия (но это означает, что абсолютные значения точки пересечения и количества последовательностей здесь не представлены).Числа над оценками параметров представляют собой отношения шансов, которые представляют отклонение в альфа-разнообразии в рамках консервативной обработки по сравнению с контрольной обработкой (судебно-медицинские мазки / замороженные).

Изменения микробиома внутри и между людьми

Когда мы тестировали на индивидуальную согласованность между консервативными обработками на основе реплик индивидуального R (Рисунок 4), результаты показали, что образцы сгруппированы в соответствии с консервационной обработкой (Таблица 4A: ΔAICc = 22.06, AICc ω = 1). Однако при исследовании вариации микробиома на основе взвешенного показателя UniFrac, включающего всех особей овец, выбор модели выявил более сильную поддержку эффекта идентичности овец, чем консервативной обработки (рис. 5, таблица 4B). Действительно, большая часть вариации объяснялась идентичностью овец (Таблица 4B: ΔAICc = 189,10; R 2 = 0,77), за которой следовала консервативная обработка (Таблица 4B: ΔAICc = 43,89; R 2 = 0,10) . Тот же анализ, основанный на невзвешенной метрике UniFrac, показал, что особи овец по-прежнему объясняют большую часть вариации (ΔAICc = 21.59; R 2 = 0,32; Дополнительная таблица 3). Интересно, что эффект консервирующей обработки получил мало поддержки (дополнительная таблица 3; ΔAICc = -9,03; R 2 = 0,06), что свидетельствует о слабом влиянии консервирующей обработки на отсутствие / присутствие ОТЕ.

Рис. 4. Анализ основных координат (PCoA) образцов овец индивидуальной R в соответствии с консервационной обработкой на основе взвешенной метрики UniFrac . Ось X и ось Y вместе объясняют 58.1% от общей вариации. Большая часть изменений объяснялась консервативной обработкой (ΔAICc = 22,06, AICc ω = 1).

Таблица 4. Выбор моделей PERMANOVA на основе взвешенной метрики UniFrac в соответствии с идентичностью овец и обработкой консервации; показаны количество параметров (k), логарифм правдоподобия (logLik), AICc моделей, изменение AICc по сравнению с моделью с лучшим рейтингом (ΔAICc) и веса модели Акаике (ω) .

Рис. 5. Анализ основных координат (PCoA) выборок всех особей овец в соответствии с консервативной обработкой на основе взвешенной метрики UniFrac .Ось X и ось Y вместе объясняют 70,8% общей вариации. Большая часть вариации была объяснена индивидуумом овцы (ΔAICc = 189,10; R 2 = 0,77) с последующей консервативной обработкой (ΔAICc = 43,89; R 2 = 0,10).

Обсуждение

В этом исследовании мы оценили влияние различных методов консервирования на состав бактериального сообщества кишечника овец, альфа- и бета-разнообразие, а также стабильность в рамках лечения.Тампоны использовались для отбора проб фекалий и были высушены на воздухе (в случае судебно-медицинских мазков) или хранились в самодельном NAP-буфере, DNA / RNA Shield ™ или RNA , позже ® , ​​и либо немедленно замораживались, либо после отбора проб хранили при комнатной температуре в течение 10 дней до выделения ДНК. Цель заключалась в том, чтобы сделать вывод о пригодности этих методов консервирования для полевых исследований, в которых замораживание или немедленная транспортировка в лабораторию для высокопроизводительного секвенирования невозможны. Мы обнаружили, что при наличии оборудования для замораживания мазки для судебно-медицинской экспертизы оставались лучшим методом сохранения.Однако, когда последнее невозможно, сохранение образцов в самодельном буфере NAP дает в целом наилучшие результаты.

Консервационная обработка повлияла на выход ДНК и глубину секвенирования, но последняя не повлияла на результаты наших статистических тестов, поскольку мы учли глубину секвенирования в наших моделях. Образцы с более низким выходом ДНК привели к более высокой глубине секвенирования, что, безусловно, связано с тем, что точность измерения ДНК ниже, когда выход ДНК низкий, что приводит к недооценке истинного выхода при нормализации образцов для секвенирования.Наши данные не позволяют нам различить, связаны ли различия в выходе ДНК с методами экстракции, связанными с буфером, или с самим буфером. Однако центрифугирование во время экстракции для РНК позже ® и буфер NAP неизбежны, поскольку клетки имеют одинаковую плотность для этих реагентов. Следовательно, любой, кто использует эти реагенты, будет обязан следовать этим шагам, поэтому мы твердо уверены, что в данном случае неважно, связаны ли различия с разными методами экстракции или буфером.Выход экстракции был ниже для всех обработок, которые не были заморожены, за исключением «ДНК / РНК Shield ™ / замороженный», что позволяет предположить, что последний буфер лучше всего сохранял целостность ДНК, когда образцы хранились при комнатной температуре.

Измерения альфа-разнообразия, полученные из «судебно-медицинских мазков / незамороженных», были очень похожи на образцы, хранящиеся в «DNA / RNA Shield ™ / замороженные», делая оба наименее разными по сравнению с контрольной обработкой. Однако пропорции OTU, принадлежащих к бактериальному типу, сильно отклонялись от контрольной обработки, показывая важность замораживания во время хранения образцов судебно-медицинских мазков.Наши результаты, основанные на невзвешенной матрице UniFrac, показывают, что сушка на воздухе образцов мазков для судебно-медицинской экспертизы в течение коротких периодов времени (10 дней в данном исследовании) перед замораживанием или выделением генетического материала допустима для исследований, которые сосредоточены только на наличии / отсутствии таксоны бактерий, но не их относительное количество. Однако следует избегать более длительных периодов сушки, поскольку различия в характеристиках образцов и климатических условиях в местах отбора образцов могут привести к более резким изменениям бактериального сообщества (Menke et al., 2015).

Мы подтвердили, что вне зависимости от того, были ли образцы заморожены или нет, затронуты микробные сообщества, например, доля OTU, принадлежащих к бактериальному типу, что также было показано в других исследованиях (Bahl et al., 2012; Flores et al., 2015) . Это контрастирует с исследованиями, в которых не было обнаружено различий в отношении обработки замораживанием, что могло быть связано с тем, что наши незамороженные образцы хранились при комнатной температуре в течение более длительного периода времени (10 дней), чем образцы этих исследований (24 часа– 3 дня; Dominianni et al., 2014; Теджо и др., 2015). Поэтому по возможности следует применять замораживание независимо от консервационной обработки. Кроме того, все методы консервации имели более низкое альфа-диверсификацию по сравнению с замороженными мазками для судебно-медицинской экспертизы. Таким образом, для полевых работ рекомендуется использовать мазки для судебно-медицинской экспертизы, если на полевом участке возможно замораживание после короткого периода сушки.

Все консервативные обработки с использованием коммерческого буфера (ДНК / РНК Shield ™ и РНК , позже ® ) оказали сильное влияние на долю OTU, принадлежащих к типу.DNA / RNA Shield ™ работал хуже, чем RNA later ® , ​​как когда образцы были заморожены, так и не заморожены, а альфа-разнообразие для «DNA / RNA Shield ™ / не заморожено» было намного ниже по сравнению со всеми другими методами консервирования. Это может быть связано с отсутствием очень низкого обилия бактериальных OTU в образцах «ДНК / РНК Shield ™ / незамороженные» по сравнению с контролем, поскольку не наблюдалось чрезмерного роста конкретных бактериальных таксонов (дополнительные данные 3). Однако удивительно, что NAP показал лучшие результаты, чем все другие виды лечения, особенно при замораживании, поскольку три наиболее распространенных типа (Firmicutes, Bacteroidetes и Verrucomicrobia) имели почти равные доли ОТЕ по сравнению с контрольным лечением.Кроме того, альфа-разнообразие образцов, сохраненных в буфере NAP, было сопоставимо с другими видами обработки, независимо от замораживания. Эти результаты являются многообещающими, поскольку они подтверждают, что самодельный буфер NAP (Camacho-Sanchez et al., 2013) является дешевой альтернативой более дорогой RNA later ® и DNA / RNA Shield ™, особенно при наличии холодильных установок. нет в наличии. Хотя рецепт буфера NAP прост, качество хранения зависит от точности человека, готовящего его в лаборатории.Это могло привести к потенциальной систематической ошибке, если образцы в рамках проекта хранились в самодельных буферах, подготовленных разными людьми. Тем не менее, этот тип ошибки можно легко устранить, если исследователи знают об этой проблеме.

В целом, на разнообразие Шеннона наблюдалось более сильное влияние консервативной обработки, чем на наблюдаемые OTU и PD, а также на взвешенную, чем на невзвешенную метрику UniFrac. Это было связано с тем, что консервативная обработка оказывала более сильное влияние на относительную численность, чем на отсутствие / присутствие таксонов (что продемонстрировано влиянием консервационной обработки на долю OTU, принадлежащих к типу, а также на взвешенные и невзвешенные Метрика UniFrac).Таким образом, следует проявлять осторожность при сравнении значений различных методов сохранения (Tedjo et al., 2015), особенно когда эти значения основаны на показателях, включающих относительную численность таксонов, таких как индекс Шеннона. С положительной стороны, несмотря на эффект консервирующей обработки, большая часть вариаций микробиомов овец объяснялась индивидуумом, как было показано в других исследованиях (Dominianni et al., 2014; Hale et al., 2015; Song et al., 2016). ), что свидетельствует о сильной последовательности отбора проб в рамках применяемого метода.Кроме того, когда исследование интересовали только данные о присутствии / отсутствии, эффект консервативной обработки был еще ниже. Таким образом, можно проводить полезные сравнения, даже если оборудование для замораживания недоступно, при условии, что один и тот же метод сохранения применяется ко всем образцам в рамках исследования.

Заключение

При отсутствии каких-либо логистических ограничений немедленное замораживание мазка для судебно-медицинской экспертизы без буфера является предпочтительным методом консервации. В ситуациях, когда требуется буфер для сохранения, наши результаты подтверждают сохраняющую способность коммерческих буферов для исследований микробиома кишечника, но также показывают, что самодельный буфер NAP дает превосходные результаты.Эффективность буфера NAP в стабилизации бактериальных сообществ в фекальных массах, собранных мазками, работает лучше, чем коммерчески доступные среды для консервации, даже когда замораживание недоступно, что делает эту недорогую самодельную консервирующую среду хорошей альтернативой для низкобюджетных исследований микробиома дикой природы в отдаленных районах области. Более того, тот факт, что NAP не считается «опасным грузом», делает эту консервирующую среду ценной в ситуациях, когда образцы должны быть отправлены по всему миру.

Доступность данных

Данные доступны из цифрового репозитория Dryad: http: // dx.doi.org/10.5061/dryad.5rk06.

Авторские взносы

Задуманы и разработаны проекты: MG, SS и KW. Проведены эксперименты: MG, KW. Биоинформатика и статистика: МГ, СМ. Написание рукописи: MG, SM, SS, KW.

Финансирование

Финансовая поддержка была предоставлена ​​грантами DFG SM (DFG SO 428 / 10-1), а также MG (DFG Gi 1065 / 2-1).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы выражают благодарность Нурай Атасой за техническую помощь и 11 овец за участие в исследовании.

Дополнительные материалы

Дополнительные материалы к этой статье можно найти в Интернете по адресу: https://www.frontiersin.org/article/10.3389/fmicb.2017.00102/full#supplementary-material

Сноски

Список литературы

Алтани, А. А., Марей, Х. Э., Хамди, В. С., Насралла, Г. К., Эль Зовалати, М. Э., Аль Ходор, С. и др. (2016). Микробиом человека и его связь со здоровьем и болезнями. J. Cell. Physiol. 231, 1688–1694. DOI: 10.1002 / jcp.25284

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Баль, М. И., Бергстрем, А., Лихт, Т. Р. (2012). Замораживание образцов фекалий перед экстракцией ДНК влияет на соотношение Firmicutes и Bacteroidetes, определенное последующим количественным анализом ПЦР. FEMS Microbiol. Lett. 329, 193–197.DOI: 10.1111 / j.1574-6968.2012.02523.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Bahrndorff, S., Alemu, T., Alemneh, T., and Lund Nielsen, J. (2016). Микробиом животных: значение для биологии сохранения. Внутр. J. Genomics 2016: e5304028. DOI: 10.1155 / 2016/5304028

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Бейтс Д., Мехлер М., Болкер Б. и Уокер С. (2015). Подгонка линейных моделей со смешанными эффектами с использованием lme4. J. Stat. Софтв. 67, 1–48. DOI: 10.18637 / jss.v067.i01

CrossRef Полный текст

Бернем, К. П., Андерсон, Д. Р., и Бернем, К. П. (2002). Выбор модели и многомодельный вывод: практический теоретико-информационный подход . Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Спрингер.

Google Scholar

Камачо-Санчес, М., Буррако, П., Гомес-Местре, И., и Леонард, Дж. А. (2013). Сохранение РНК и ДНК из образцов млекопитающих в полевых условиях. Мол.Ecol. Ресурс. 13, 663–673. DOI: 10.1111 / 1755-0998.12108

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Caporaso, J. G., Kuczynski, J., Stombaugh, J., Bittinger, K., Bushman, F. D., Costello, E. K., et al. (2010). QIIME позволяет анализировать данные секвенирования сообщества с высокой пропускной способностью. Нат. Методы 7, 335–336. DOI: 10.1038 / nmeth.f.303

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Капорасо, Дж. Г., Лаубер, К.Л., Уолтерс, В. А., Берг-Лайонс, Д., Лозупоне, К. А., Тернбо, П. Дж. И др. (2011). Глобальные паттерны разнообразия 16S рРНК на глубине миллионов последовательностей на образец. Proc. Natl. Акад. Sci. США 108 (Приложение 1), 4516–4522. DOI: 10.1073 / pnas.1000080107

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

ДеСантис, Т.З., Хугенхольц, П., Ларсен, Н., Рохас, М., Броди, Э.Л., Келлер, К. и др. (2006). Greengenes, проверенная химерами база данных генов 16S рРНК и рабочая среда, совместимая с ARB. Заявл. Environ. Microbiol. 72, 5069–5072. DOI: 10.1128 / AEM.03006-05

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Эдгар Р. К., Хаас Б. Дж., Клементе Дж. К., Айва К. и Найт Р. (2011). UCHIME улучшает чувствительность и скорость обнаружения химер. Биоинформатика 27, 2194–2200. DOI: 10.1093 / биоинформатика / btr381

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вера, Д. П., и Бейкер, А. М. (2007).Филогенетическое разнообразие (PD) и сохранение биоразнообразия: некоторые проблемы биоинформатики. Evol. Bioinforma Online 2, 121–128.

PubMed Аннотация | Google Scholar

Флорес, Р., Ши, Дж., Ю, Г., Ма, Б., Равель, Дж., Гёдерт, Дж. Дж. И др. (2015). Среда для сбора и эффекты замедленного замораживания на микробный состав человеческого стула. Микробиом 3:33. DOI: 10.1186 / s40168-015-0092-7

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Фухи, Ф., Дин, Дж., Ри, М. К., О’Салливан, О., Росс, Р. П., О’Каллаган, Г. и др. (2015). Воздействие замораживания на фекальную микробиоту, определенное с помощью секвенирования MiSeq и исследований на основе культур. PLoS ONE 10: e0119355. DOI: 10.1371 / journal.pone.0119355

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Го Ю., Ли, С.-Х., Куанг, Ю.-С., Хе, Дж.-Р., Лу, Дж.-Х., Луо, Б.-Дж., и др. (2016). Влияние кратковременного хранения при комнатной температуре на микробное сообщество в образцах кала младенцев. Sci. Отчет 6: 26648. DOI: 10.1038 / srep26648

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Хейл В. Л., Тан К. Л., Найт Р. и Амато К. Р. (2015). Влияние метода консервации на микробиоту фекалий обезьяны-паука ( Ateles geoffroyi ) в течение 8 недель. J. Microbiol. Методы 113, 16–26. DOI: 10.1016 / j.mimet.2015.03.021

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Кау, А.Л., Ахерн, П.П., Гриффин, Н. В., Гудман, А. Л., и Гордон, Дж. И. (2011). Питание человека, микробиом кишечника и иммунная система. Природа 474, 327–336. DOI: 10.1038 / природа10213

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лозупоне, К., и Найт, Р. (2005). UniFrac: новый филогенетический метод сравнения микробных сообществ. Заявл. Environ. Microbiol. 71, 8228–8235. DOI: 10.1128 / AEM.71.12.8228-8235.2005

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Лозупоне, К., Лладсер, М. Э., Найтс, Д., Стомбо, Дж., И Найт, Р. (2011). UniFrac: эффективный показатель расстояния для сравнения микробного сообщества. ISME J. 5, 169–172. DOI: 10.1038 / ismej.2010.133

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Мартин, М. (2011). Cutadapt удаляет последовательности адаптеров из операций чтения с высокой пропускной способностью. EMBnet. J. 17, 10–12. DOI: 10.14806 / ej.17.1.200

CrossRef Полный текст

Менке, С., Мейер, М., Соммер, С. (2015). Изменения микробиома кишечника, наблюдаемые в образцах фекалий диких животных, подвергшихся воздействию естественных погодных условий: уроки анализа временных рядов с использованием секвенирования следующего поколения для применения в полевых исследованиях. Methods Ecol. Evol. 6, 1080–1087. DOI: 10.1111 / 2041-210X.12394

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Накагава С. и Катхилл И. С. (2007). Размер эффекта, доверительный интервал и статистическая значимость: практическое руководство для биологов. Biol. Ред. 82, 591–605. DOI: 10.1111 / j.1469-185X.2007.00027.x

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Nechvatal, J. M., Ram, J. L., Basson, M. D., Namprachan, P., Niec, S. R., Badsha, K. Z., et al. (2008). Сбор фекалий, сохранение в окружающей среде и выделение ДНК для ПЦР-амплификации бактериальных и человеческих маркеров из человеческих фекалий. J. Microbiol. Методы 72, 124–132. DOI: 10.1016 / j.mimet.2007.11.007

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

О’Догерти, К.К., Вирани А. и Уилкокс Е. С. (2016). Микробиом человека и общественное здоровье: СОЦИАЛЬНЫЕ и этические соображения. Am. J. Public Health 106, 414–420. DOI: 10.2105 / AJPH.2015.302989

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Оксанен, Дж., Гийом Бланше, Ф., Киндт, Р., Лежандр, П., Минчин, П. Р., О’Хара, Р. Б. и др. (2014). веган: Пакет «Экология сообщества». Пакет R Версия 2.2-0 . Доступно в Интернете по адресу: http: //CRAN.R-project.org / package = веганский

Пинейро, Дж., Бейтс, Д., ДебРой, С., Саркар, Д., и Р. Основная группа (2016). nlme: Линейные и нелинейные модели смешанных эффектов. Пакет R версия 3, 1–128 . Доступно в Интернете по адресу: http://CRAN.R-project.org/package=nlme

Quast, C., Pruesse, E., Yilmaz, P., Gerken, J., Schweer, T., Yarza, P., et al. (2013). Проект базы данных генов рибосомных РНК SILVA: улучшенная обработка данных и веб-инструменты. Nucleic Acids Res. 41, D590 – D596.DOI: 10.1093 / nar / gks1219

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст

Солтер, С. Дж., Кокс, М. Дж., Турек, Э. М., Калус, С. Т., Куксон, В. О., Моффат, М. Ф. и др. (2014). Загрязнение реагентов и лабораторий может критически повлиять на анализ микробиома, основанный на последовательностях. BMC Biol. 12:87. DOI: 10.1186 / s12915-014-0087-z

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зёргель Д. А., Дей Н., Найт Р. и Бреннер С. Э. (2012). Выбор праймеров для оптимальной таксономической классификации последовательностей гена 16S рРНК окружающей среды. ISME J. 6, 1440–1444. DOI: 10.1038 / ismej.2011.208

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Сонг, С. Дж., Амир, А., Меткалф, Дж. Л., Амато, К. Р., Сюй, З. З., Хамфри, Г. и др. (2016). Методы консервации различаются по стабильности фекального микробиома, что влияет на пригодность для полевых исследований. mSystems 1, e00021 – e00016. DOI: 10.1128 / mSystems.00021-16

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Спеллерберг, И.Ф., и Федор П. Дж. (2003). Дань уважения Клоду Шеннону (1916–2001) и призыв к более строгому использованию видового богатства, видового разнообразия и индекса «Шеннона – Винера». Glob. Ecol. Биогеогр. 12, 177–179. DOI: 10.1046 / j.1466-822X.2003.00015.x

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Штумпф Р. М., Гомес А., Амато К. Р., Йоман К. Дж., Полк Дж. Д., Уилсон Б. А. и др. (2016). Микробиомы, метагеномика и сохранение приматов: новые стратегии, инструменты и приложения. Biol. Консерв. 199, 56–66. DOI: 10.1016 / j.biocon.2016.03.035

CrossRef Полный текст | Google Scholar

Теджо, Д. И., Йонкерс, Д. М. А. Э., Савелкул, П. Х., Маскли, А. А., ван Бест, Н., Пиерик, М. Дж. И др. (2015). Влияние отбора и хранения образцов на состав фекальной микробиоты у здоровых и больных людей. PLoS ONE 10: e0126685. DOI: 10.1371 / journal.pone.0126685

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Ван, К., Гаррити, Г. М., Тидже, Дж. М., и Коул, Дж. Р. (2007). Наивный байесовский классификатор для быстрого отнесения последовательностей рРНК к новой бактериальной таксономии. Заявл. Environ. Microbiol. 73, 5261–5267. DOI: 10.1128 / AEM.00062-07

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Вуд, С. (2006). Обобщенные аддитивные модели: введение в R. Бока Ратон, Флорида: CRC Press.

Google Scholar

Ву, Г. Д., Льюис, Дж. Д., Хоффманн, К., Чен, Й.-Й., Найт, Р., Биттингер, К., и др. (2010). Методы отбора проб и пиросеквенирования для характеристики бактериальных сообществ в кишечнике человека с использованием тегов последовательности 16S. BMC Microbiol. 10: 1. DOI: 10.1186 / 1471-2180-10-206

PubMed Аннотация | CrossRef Полный текст | Google Scholar

Зуур А., Иено Э. Н., Уокер Н., Савельев А. А. и Смит Г. М. (2009). Модели смешанных эффектов и расширения в области экологии с R . Берлин: Springer.

Самодельный экономичный буфер для консервации — лучшая альтернатива коммерческим методам консервации для исследования микробиома

Front Microbiol.2017; 8: 102.

Институт эволюционной экологии и геномики сохранения, Ульмский университет, Ульм, Германия

Отредактировал: Вольфганг Р. Штрайт, Гамбургский университет, Германия

Рецензент: Кристофер С. Миллер, Колорадский университет в Денвере , США; Серджио Уззау, Университет Сассари, Италия

Эта статья была отправлена ​​в Системную микробиологию, раздел журнала Frontiers in Microbiology

Поступила 28 сентября 2016 г .; Принято 13 января 2017 г.

Copyright © 2017 Menke, Gillingham, Wilhelm and Sommer.

Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License (CC BY). Использование, распространение или воспроизведение на других форумах разрешено при условии указания автора (авторов) или лицензиара и ссылки на оригинальную публикацию в этом журнале в соответствии с принятой академической практикой. Запрещается использование, распространение или воспроизведение без соблюдения этих условий.

Эта статья цитируется в других статьях в PMC.
Вспомогательные материалы

GUID: E574A45D-A2C5-434A-BF63-4E516165C813

GUID: 23FAE945-4654-4A9E-931C-078580F05B8E

GUID60004

GUID: B27487CE

GUID627487CE

GUID627487000: B27487CE

952B-4944-BC6F-28CCDD973C0D

Идентификатор GUID: E52E68B0-27FB-4149-AF4D-2EF32F235CA1

Идентификатор GUID: 2753CFAB-E8CC-4605-A7E0-FEC8E2F420846-A7E0-FEC8E2F4208472

9000 9000: 9608E2F40003 Заявление о доступности данных

Данные доступны из цифрового репозитория Dryad: http: // dx.doi.org/10.5061/dryad.5rk06.

Abstract

Исследование микробиомов желудочно-кишечного тракта диких животных с помощью подходов секвенирования нового поколения — это растущая область микробной экологии и сохранения. Такие исследования часто сталкиваются с трудностями при сохранении образцов, если нет доступных морозильных установок или жидкого азота (LQN). Таким образом, чтобы предотвратить изменения микробного сообщества из-за роста бактерий после отбора образцов, к образцам необходимо применять консервационные буферы.Однако количество вариаций микробного сообщества, связанное с различными методами консервирования и потенциально влияющее на биологическую интерпретацию, вряд ли известно. Здесь мы взяли пробы фекалий 11 овец ( Ovis aries sp.) С помощью тампонов и проанализировали эффект сушки на воздухе, недорогого самодельного буфера для сохранения нуклеиновых кислот (NAP), ДНК / РНК Shield ™ и РНК . позже ®, каждый вместе с замораживанием (в течение 10 дней) или хранением при комнатной температуре (в течение 10 дней) перед высокопроизводительным секвенированием гена 16S рРНК для определения бактериальных сообществ.Результаты показали, что пропорции операционных таксономических единиц (OTU), принадлежащих к бактериальному типу, были затронуты консервативными обработками, и что альфа-разнообразие [наблюдаемые OTU, индекс Шеннона и филогенетическое разнообразие (PD)] были ниже при всех консервативных обработках, чем в пробы, взятые с помощью мазков для судебно-медицинской экспертизы и немедленно замороженные, что считается предпочтительным методом консервирования при отсутствии каких-либо логистических ограничений. В целом, NAP обладает лучшими защитными качествами, чем RNA , более поздняя версия ® и DNA / RNA Shield ™, что делает этот самодельный буфер ценным решением в исследованиях микробиома дикой природы.

Ключевые слова: микробиом кишечника, образцы фекалий, сохранение образцов, мазки, буфер, замораживание, овца, секвенирование следующего поколения

Введение

Недавние достижения в области высокопроизводительного секвенирования, вычислительных методов и новых инструментов биоинформатики значительно расширились наши знания о полезной роли симбиотических кишечных микробов в питании хозяина, иммунной системе и социальных взаимодействиях, а также о негативных последствиях нарушений микробиома, способствующих развитию заболеваний человека (Kau et al., 2011; Чо и Блазер, 2012; Althani et al., 2016; O’Doherty et al., 2016). В последнее время эта быстрорастущая область исследований распространилась на диких животных, о микробиомах кишечника которых известно относительно мало. Действительно, исследования микробиома кишечника немодельных видов, для которых ранее не хватало такой информации, становятся все более популярными и подчеркивают важные аспекты, касающиеся здоровья и сохранения животных (Bahrndorff et al., 2016; Stumpf et al., 2016).

Обычно микробиомы кишечника изучаются путем секвенирования филогенетически важных фрагментов гена рибосомной РНК 16S, амплифицированных из фекальных ДНК-изолятов, с использованием одной комбинации праймеров.Поскольку эти праймеры амплифицируются среди бактериальных таксонов, этот простой и экономичный подход обеспечивает идеальные наборы данных для анализа микробного сообщества (Soergel et al., 2012). После первоначальной качественной фильтрации полученные считывания группируются в соответствии с порогом сходства, сравниваются с бактериальными базами данных для присвоения таксономии (DeSantis et al., 2006; Quast et al., 2013) и вместе с информацией о численности на одного человека. бактериальный таксон, записываются в так называемую таблицу операционных таксономических единиц (OTU).Впоследствии исследуется влияние внутренних или внешних факторов на микробное сообщество и соответствующие меры разнообразия. Поскольку многие из этих мер включают информацию о бактериальном разнообразии, филогении и численности по таксону, изменения в бактериальных сообществах, связанные с ненадлежащим хранением исходного образца фекалий, будут искажать результаты и последующие биологические выводы.

Оптимальной отправной точкой для таких исследований микробиома кишечника является достаточное количество свежего незагрязненного образца фекалий, из которого немедленно выделяется ДНК.Если это невозможно, то свежие образцы следует немедленно заморозить до проведения лабораторных анализов (Wu et al., 2010; Choo et al., 2015; Fouhy et al., 2015; Hale et al., 2015). Замораживание образцов подавляет рост бактерий, и ингибиторы не препятствуют выделению ДНК и амплификации генов-мишеней, как в случае некоторых сред для консервации (Nechvatal et al., 2008). Однако это часто невозможно в полевых условиях, особенно в исследовательских проектах по отбору проб дикой природы в отдаленных районах, в которых нет ни морозильных установок, ни жидкого азота (LQN).

В настоящее время доступно несколько консервационных сред, обещающих сохранение характеристик образца с момента сбора фекалий до выделения ДНК и даже более чувствительной РНК. DNA / RNA Shield ™ и RNA позже ® часто используются в качестве консервативной среды для сохранения ДНК и РНК в различных типах образцов. Из-за их стоимости также часто используются более дешевые альтернативы, такие как сушка на воздухе определенных тампонов или использование этанола (Guo et al., 2016). Последний, однако, имеет недостатки, так как его характеризует как «опасный груз», что вызывает ограничения при международных перевозках на самолете. В других исследованиях исследовательские группы разработали свою собственную формулу для среды для сохранения, такой как самодельный буфер для сохранения нуклеиновых кислот (NAP) (Camacho-Sanchez et al., 2013).

Здесь мы использовали стерильные мазки для взятия образцов фекалий 11 овец и обрабатывали образцы в соответствии с различными методами консервирования в течение 10 дней до выделения ДНК: (1) мазки для судебно-медицинской экспертизы (замороженные / незамороженные), (2) NAP ( заморожено / не заморожено), (3) ДНК / РНК Shield ™ (заморожено / не заморожено) и (4) РНК позже ® (заморожено / не заморожено).Тампоны — чрезвычайно практичный инструмент для отбора проб бактерий, поскольку они стерильны, могут легко храниться в пробирках Эппендорфа объемом 2 мл и, что наиболее важно, не причиняют вреда хозяевам. Тем не менее, исследование микробиомов кишечника на основе образцов фекальных мазков, которые обычно имеют небольшое количество образцов, может потребовать хорошей консервационной обработки, поскольку микробные сообщества могут быстро отличаться от своего исходного состояния из-за сильного воздействия атмосферного кислорода на бактериальное сообщество ( Menke et al., 2015; Теджо и др., 2015). Мы рассматривали обработку «судебно-медицинские мазки / замороженные» в качестве контрольной обработки, поскольку это была бы предпочтительная консервативная обработка при отсутствии ограничений, связанных с полевыми условиями и ограничениями на транспортировку. Мы исследовали, влияет ли консервативная обработка на характеристики микробных сообществ кишечника овец и их альфа- и бета-разнообразие, а также оценили согласованность результатов секвенирования на основе повторных образцов в рамках консервативных обработок.Насколько нам известно, это единственное исследование, в котором изучалось влияние консервирующих сред в сочетании с замораживанием / незамораживанием на образцы кишечного микробиома как от нескольких человек, так и в повторностях внутри отдельного человека.

Методы

Обработка образцов фекалий

Мы собрали образцы фекалий 11 овец ( Ovis aries sp.), Содержащихся на частном лугу в Баден-Вюртемберге, Германия. Образцы кала сразу же тщательно перемешивали в пластиковом пакете для получения однородного образца кала.Чтобы оценить влияние различных методов консервирования (мазки для судебно-медицинской экспертизы, буфер NAP, ДНК / РНК Shield ™ и RNA позже ®) и условий хранения (комнатная температура, замораживание), мы взяли по восемь мазков из каждого образца фекалий. Два мазка для судебно-медицинской экспертизы (Sarstedt, Nuembrecht, Германия) помещали в 2 мл пробирки Eppendorf без консервирующей среды. Один сразу замораживали при -20 ° C, а другой хранили при комнатной температуре. Тампоны для судебной экспертизы имеют вентиляционную мембрану, которая обеспечивает процесс высыхания на воздухе, одновременно защищая от загрязнения.Кроме того, было взято шесть образцов фекалий с помощью FLOQSwabs ™ (Copan Flock Technologies, Брешиа, Италия). Два из них были сохранены в 2 мл пробирках Эппендорфа, содержащих 600 мкл самодельной среды NAP (NAP; Camacho-Sanchez et al., 2013), два были сохранены в 600 мкл РНК позже ®, и два были сохранены в 600 мкл ДНК / RNA Shield ™ (Zymo Research, Фрайбург, Германия). Свабы FLOQSwab сконструированы таким образом, что они высвобождают весь образец в консервирующую среду. После каждой консервативной обработки одну пробирку, содержащую тампон, замораживали при -20 ° C после инкубации с буфером в течение 4 часов, тогда как второй тампон хранили в буфере для консервации при комнатной температуре.ДНК экстрагировали из всех образцов после 10 дней хранения в соответствующих условиях хранения. Мы рассматривали судебно-медицинский мазок / замороженное лечение в качестве контрольного лечения для всех последующих анализов.

Чтобы исследовать консистенцию внутри образца и, таким образом, эффект консервационного буфера независимо от различий между особями, мы взяли 41 мазок для одной из 11 овец (особь R ). Из них пять мазков для судебно-медицинской экспертизы были высушены на воздухе (мазки для судебно-медицинской экспертизы / замороженные образцы не были доступны для индивидуального R ), 12 мазков хранились в NAP (6 — при комнатной температуре, 6 — в замороженном виде до экстракции через 10 дней), 12 тампонов в DNA / RNA Shield ™ (6 при комнатной температуре, 6 замороженных) и 12 тампонов в RNA , позже ® (6 при комнатной температуре, 6 замороженных).Наконец, для контроля перекрестного загрязнения мы секвенировали восемь холостых образцов [NAP (3), DNA / RNA Shield ™ (3) или вода (2)], которые случайным образом помещали среди реальных образцов во время экстракции ДНК и полимеразной цепной реакции ( ПЦР) амплификация.

Очистка ДНК микробиома

Консервационная среда, испытанная в этом исследовании, требовала различных обработок перед экстракцией ДНК. Поскольку NAP и РНК позже ® имеют плотность, аналогичную плотности бактериальных клеток, которые были высвобождены из тампона в раствор, повторно осаждают клетки центрифугированием.Кроме того, РНК и более поздняя ® могут вмешиваться в процесс выделения ДНК (Athanasio et al., 2016). Чтобы удалить NAP и РНК , а затем ® из наших образцов, мы разбавили их, добавив равные объемы ледяного фосфатно-солевого буфера (PBS) перед центрифугированием при 6000 g в течение 15 минут, как рекомендовано в руководстве (Life Technologies, 2011) и отбросили супернатант. DNA / RNA Shield ™ имеет более похожую на воду плотность и может использоваться без удаления реагента в большинстве наборов для очистки ДНК; поэтому мы не проводили предварительную обработку этих образцов.Высушенные на воздухе судебно-медицинские тампоны замачивали в 1 мл буфера InhibitEx из набора QIAamp® Fast DNA Stool Mini Kit (Qiagen, Hilden, Германия). Осажденный материал (NAP, РНК , позже ®) и растворенный материал (ДНК / РНК Shield ™) смешивали с 1 мл буфера InhibitEx и гомогенизировали с керамическими шариками в течение 2 × 3 мин на SpeedMill (Analytik Jena, Германия). После этого мы следовали протоколу производителя по выделению ДНК из стула для обнаружения патогенов.

ПЦР-амплификация, подготовка библиотеки и высокопроизводительное секвенирование

Извлеченную ДНК амплифицировали с универсальными бактериальными праймерами 515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3 ‘) и 806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’) для амплификации 291 -bp фрагмент гипервариабельной области V4 гена 16S рРНК (Caporaso et al., 2010, 2011). Поэтому мы следовали схеме маркировки 4-праймерных ампликонов Fluidigm (система Access Array ™ для систем секвенирования Illumina, © Fluidigm Corporation), в которой меченые целевые специфические праймеры (CS1-TS-515F и CS2-TS-806R) были объединены с образцом. -специфические пары праймеров, которые содержат последовательность штрих-кодирования и последовательности адаптера, используемые системами секвенирования Illumina. Мы добавили четыре случайных основания к нашим прямым праймерам, чтобы избежать ошибок во время идентификации кластера из-за высокого сходства оснований для всех ампликонов в циклах идентификации кластера.Мы использовали химию Fluidigm с начальной ПЦР ампликона с последующей второй ПЦР со штрих-кодированием.

Первоначальный объем ПЦР 10 мкл содержал 3-5 нг экстрагированной ДНК, 0,5 единиц ДНК-полимеразы FastStart Taq (Roche Applied Science, Мангейм, Германия), 1х буфер для ПЦР, 4,5 мМ MgCl 2 , 250 мкМ каждого dNTP, 0,5 мкМ праймеры и 5% диметилсульфоксид (ДМСО). ПЦР проводили с этапом активации при 95 ° C в течение 4 минут, затем 30 циклов при 95 ° C в течение 30 секунд, 60 ° C в течение 30 секунд, 72 ° C в течение 45 секунд и окончательной элонгации при 72 ° C в течение 10 минут.Объем ПЦР со штрих-кодированием (20 мкл) содержал 2 мкл исходного продукта ПЦР, 1 единицу ДНК-полимеразы FastStart Taq, 1x буфер для ПЦР, 4,5 мМ MgCl 2 , 200 мкМ каждого dNTP и 80 нМ на праймер штрих-кода. Условия ПЦР были такими же, как и раньше, но было выполнено только 10 циклов. Амплификации количественно оценивали УФ / видимой спектроскопией на Xpose (Trinean, Gentbrugge, Бельгия), и образцы объединяли до эквимолярных количеств ДНК. Библиотека была подготовлена ​​в соответствии с рекомендациями компании Illumina (Miseq Reagent Kit v2 — Руководство по подготовке реагентов) и загружена на 7.17:00 на проточной кювете MiSeq с добавлением 10% PhiX. Секвенирование парных концов выполняли в течение 2 × 251 цикл.

Bioinformatics

Для подготовки чтения для анализа бактериального сообщества в QIIME [версия 1.9.1; (Caporaso et al., 2010)] и phyloseq (McMurdie and Holmes, 2013), мы выполнили следующие шаги, используя параметры по умолчанию, если не указано иное. Мы (а) объединили парные чтения ( multiple_join_paired_ends.py сценарий в QIIME), (б) применили порог качества q = 30 и процент баз, которые должны иметь это качество, с p = 75 [ fastq_quality_filter.py скрипт в fastx-toolkit (FASTX-Toolkit) 1 ], (c) преобразовал файлы fastq в файлы fasta ( сценарий fastq_to_fasta.py в fastx-toolkit) и (d) вырезал праймеры с помощью cutadapt (Martin , 2011). Затем полученные считывания использовались в качестве отправной точки для дальнейших анализов в QIIME, таких как проверка химер, кластеризация OTU, фильтрация небактериальной ДНК и расчет альфа- и бета-разнообразия. Проверка химеры была проведена с помощью USEARCH (Эдгар и др., 2011) против rep_set / 97_otus.fasta (Greengenes версии 13.5.) (сценарий identify_chimeric_seqs.py ) базы данных Greengenes (http://greengenes.lbl.gov,). Затем мы применили подход с открытой эталонной кластеризацией OTU (сценарий pick_open_reference_otus.py ) с порогом сходства 0,97 также к базе данных Greengenes, снова с помощью USEARCH (usearch61; Edgar, 2010), а таксономия была назначена с помощью RDP. классификатор (Wang et al., 2007). Впоследствии вся небактериальная ДНК была удалена из набора данных ( filter_taxa_from_otu_table.py ) с использованием соответствующих идентификаторов (k_Eukaryota, c_Chloroplast, f_Mitochondria, k_Archaea).

Статистический анализ

Влияние выхода ДНК на результаты секвенирования

Мы проверили влияние консервативной обработки на выход ДНК, используя обобщенную модель наименьших квадратов (GLS). Переменная ответа представляла собой логарифмически преобразованный выход ДНК плюс один, а объясняющая переменная была консервативной обработкой («судебно-медицинские мазки / заморожены», «судебно-медицинские мазки / не заморожены», «NAP / заморожены», «NAP / не заморожены», «ДНК / РНК. Shield ™ / заморожен »,« ДНК / РНК Shield ™ / не заморожен »,« РНК позже ® / заморожен »или« РНК позже ® / не заморожен »).Неоднородность между консервационными обработками контролировалась (Zuur et al., 2009). Мы исследовали, различалась ли глубина секвенирования в зависимости от выхода ДНК и консервативной обработки, с использованием линейной модели смешанных эффектов (LMM) (Zuur et al., 2009; Pinheiro et al., 2016). Переменная ответа представляла собой логарифмически преобразованное число последовательностей, а независимыми переменными были консервативная обработка и выход ДНК. Были масштабированы как переменная ответа, так и выход ДНК. (т.е. каждое значение вычиталось из среднего значения совокупности и делилось на стандартное отклонение совокупности).Случайным фактором была идентичность овцы. Выбор модели был достигнут посредством выбора модели, основанной на теории информации (I – T) (Burnham et al., 2002). Все возможные модели-кандидаты были построены с использованием переменных-предикторов, описанных выше. Информационный критерий Акаике, скорректированный с учетом малых размеров выборки (AICc), и веса AICc (ω) использовались для оценки относительной силы поддержки моделей (Burnham et al., 2002; Johnson and Omland, 2004).

Влияние консервативных обработок на измерения альфа-разнообразия

Изучить влияние консервационных обработок на долю ОТЕ, принадлежащих к пяти наиболее распространенным типам ( Firmicutes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Proteobacteria, Spirochaetes ), и на долю ОТЕ, принадлежащих для остальных типов мы использовали обобщенную линейную смешанную модель (GLMM) с биномиальным распределением, используя пакет lme4 в R (Bates et al., 2015). Мы включили консервативную обработку («судебно-медицинские мазки / замороженные», «судебно-медицинские мазки / не замороженные», «NAP / замороженные», «NAP / незамороженные», «DNA / RNA Shield ™ / замороженные», «DNA / RNA Shield ™» / не заморожен »,« РНК позже ® / заморожен »или« РНК позже ® / не заморожен ») в качестве объясняющей переменной. Случайным фактором была идентичность овцы. Опять же, выбор модели был достигнут посредством выбора теоретико-информационной (I – T) модели (Burnham et al., 2002). Информационный критерий Акаике, скорректированный для малых размеров выборки (AICc), и веса AICc (ω) были использованы для оценки относительной силы поддержки моделей (Burnham et al., 2002; Джонсон и Омланд, 2004 г.). Чтобы оценить относительное отклонение в доле OTU, принадлежащих к типу, между консервативными обработками, мы построили графики оценок параметров моделей GLMM (с контрольной обработкой «судебно-медицинские мазки / замороженные» в качестве точки пересечения). Кроме того, мы оценили отношение шансов размера эффекта (OR; Nakagawa and Cuthill, 2007), чтобы измерить отклонение в доле OTU, принадлежащих к типу в рамках консервативной обработки, по сравнению с контрольной обработкой. Отношение шансов измеряет шансы возникновения OTU при условии, что образец сохраняется в исследуемой консервативной обработке или в контрольной консервационной обработке ( OR = 1 указывает на отсутствие разницы в шансах между исследуемой консервационной обработкой или контрольной обработкой; OR > 1 указывает на увеличение шансов в исследуемой консервативной обработке; а OR <1 указывает на уменьшение шансов в исследованной консервационной обработке).

Чтобы сравнить влияние различных методов консервирования на бактериальное разнообразие с учетом глубины секвенирования, мы рассчитали три индекса альфа-разнообразия («наблюдаемые OTU» (т. Е. Просто количество OTU), «разнообразие Шеннона» Spellerberg and Fedor, 2003, и «филогенетическое разнообразие» (PD, Faith and Baker, 2007) для каждого образца микробиома кишечника. Все показатели альфа-разнообразия были масштабированы, чтобы облегчить сравнение эффекта консервативной обработки между показателями альфа-разнообразия.Для статистического тестирования мы использовали общие аддитивные смешанные модели (GAMM) с распределением Гаусса, функцией связи идентичности и оценкой максимального правдоподобия (ML) с помощью пакета «mgcv» в R (Wood, 2006). Консервационная обработка («судебно-медицинские мазки / замороженные», «судебно-медицинские мазки / незамороженные», «NAP / замороженные», «NAP / незамороженные», «DNA / RNA Shield ™ / замороженные», «DNA / RNA Shield ™ / не замороженные»). заморожено »,« РНК позже ® / заморожено »или« РНК позже ® / не заморожено »), а количество последовательностей было введено в качестве независимых переменных.Последний был включен как более сглаживающий член, а максимальная эффективная степень свободы (e.d.f), определяющая степень сглаживания, была ограничена пятью. Идентичность овец использовалась в качестве случайного фактора, и мы контролировали гетерогенность между консервирующей средой и замораживанием (Zuur et al., 2009). Выбор модели был достигнут посредством выбора модели, основанной на теории информации (I – T), как описано выше (Burnham et al., 2002). Также, как указано выше, мы построили оценки параметров моделей GAMM и рассчитали OR в рамках консервативной обработки относительно контрольной обработки (судебно-медицинские мазки / замороженные) в качестве величины эффекта.Отношения шансов можно рассчитать, если независимая переменная является непрерывной; однако в этом случае OR варьируются в зависимости от единиц измерения (Nakagawa and Cuthill, 2007). Поскольку объясняющие переменные были масштабированы, можно сравнить относительный эффект консервативной обработки на альфа-разнообразие между различными показателями, но OR не являются показателем абсолютного эффекта консервационной обработки на отдельные показатели альфа-разнообразия.

Влияние консервативных обработок на бета-разнообразие

Чтобы сравнить влияние различных консервативных обработок на бета-разнообразие, мы рассчитали взвешенную и невзвешенную метрику UniFrac (Lozupone and Knight, 2005; Lozupone et al., 2011), который включает информацию о бактериальной филогении, с использованием пакета R «phyloseq.» Мы создали матрицу расстояний, включающую всех людей, и матрицу только с индивидуумом R . Мы протестировали влияние отдельных овец (включая всех особей) и консервативной обработки на взвешенные и невзвешенные матрицы расстояний UniFrac, используя подход PERMANOVA [функция адониса в R-пакете «веганский», (Oksanen et al., 2014)]. Мы использовали как взвешенные, так и невзвешенные показатели UniFrac, чтобы проверить, оказывают ли методы сохранения более сильное влияние на относительную численность, чем на наличие / отсутствие OTU.Выбор модели был достигнут посредством выбора модели, основанной на теории информации (I – T), как описано выше (Burnham et al., 2002). Мы также указываем величину вариации, объясняемую каждой независимой переменной как R 2 , ​​как определено в функции adonis в пакете R «веганский».

Заявление об одобрении этических норм

Овцы из этого исследования находятся в частной собственности Райнхольда Вильгельма. Содержание этих животных одобрено Министерством питания, сельского и лесного хозяйства (AELF) в Вертингене (номер основных данных участка: 097731130105).Образцы были собраны после естественной и добровольной дефекации. Таким образом, для нашего исследования не требуется одобрение этических норм.

Результаты

Взаимосвязь между консервативной обработкой, выходом ДНК и глубиной секвенирования

Выход ДНК различается между консервативной обработкой (ΔAICc = 34,21, AICc ω = 1, дополнительная таблица 1, рисунок). Образцы, которые были заморожены перед очисткой ДНК, приводили к более высоким концентрациям, чем незамороженные образцы при всех обработках, за исключением обработок DNA / RNA Shield ™ (рисунок).Выбор модели подтвердил отрицательную взаимосвязь между глубиной секвенирования и выходом ДНК (ΔAICc = 7,13, дополнительная таблица 1, дополнительный рисунок 1). Выбор модели также подтвердил различия в глубине секвенирования между консервативными обработками (ΔAICc = 8,44, дополнительный рисунок 1). Однако только «ДНК / РНК Shield ™ / не замороженный» имел значительно более высокую глубину секвенирования по сравнению с контрольной обработкой (дополнительный рисунок 1).

Различия в выходе ДНК при консервации.(A) Оценка параметров моделей GLS выхода экстракции ДНК в соответствии с консервативной обработкой. (B) Log (выход ДНК +1) для каждого образца соответствующей консервативной обработки.

Необработанные данные прогонов секвенирования

Мы успешно секвенировали бактериальный ген 16S рРНК в 114 из 122 образцов фекалий овец (дополнительные данные 1, дополнительная таблица 2), в результате чего было получено 3 681 449 считываний после слияния считываний парных концов. После того, как были выполнены все биоинформатические шаги, окончательная таблица OTU была построена на 2 575 354 считывания в диапазоне от 7101 до 185 518 считываний на человека (среднее значение = 22 591, SD, = 17 555).Примечательно, что «РНК позже ® / замороженная» была единственной консервативной обработкой, для которой не происходило выпадения при секвенировании. Последовательности, полученные из пустых образцов, содержали только несколько последовательностей (среднее: 504,5, диапазон: 114–1573), в которых преобладали бактериальные типы Proteobacteria и Actinobacteria, скорее всего, из-за бактериального загрязнения, присутствующего в используемых наборах для экстракции (Salter et al. , 2014). Для OTU, обнаруженного в холостых пробах (экстракция и ПЦР-бланки), максимальная доля прочтений в образце овцы составляла 0.04% (и средний максимум для каждой OTU, присутствующей в холостом образце, обнаруженном в образце овцы, составлял 0,00004%; дополнительные данные 2). Поэтому маловероятно, что загрязнение буферами, а также перекрестное загрязнение окажут заметное влияние на результаты проб овец.

Относительная численность бактериального типа

Бактериальным типом с самой высокой долей ОТЕ во всех вариантах консервирования были Firmicutes [среднее значение 54,60, 95% ДИ (51,34, 57,12)], Bacteroidetes [среднее значение 33.45, 95% ДИ (31,34, 35,91)], веррукомикробия [среднее значение 3,28, 95% ДИ (2,79, 3,74)], протеобактерии [среднее значение 2,49, 95% ДИ (1,96, 3,22)] и спирохеты [среднее значение 2,04, 95% CI (1.12, 3.10)] (таблица; см. Дополнительные данные 3 для максимально возможного таксономического разрешения). Выбор модели выявил сильную поддержку эффекта консервативных обработок на долю OTU, принадлежащих Firmicutes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Proteobacteria, Spirochaetes и другим менее многочисленным типам (рисунок, таблица).Для трех наиболее распространенных бактериальных типов, которые доминировали в бактериальном сообществе (Firmicutes, Bacteroidetes и Verrucomicrobia), «NAP / замороженный» был консервативной обработкой, которая меньше всего отклонялась от контрольной обработки (рисунок). Действительно, для Firmicutes и Verrucomicrobia 95% доверительные интервалы оценок параметров перекрывали ноль, а OR были близки к 1 для всех трех типов (рисунок). Консервационная обработка «NAP / замороженный» привела к увеличению доли ОТЕ, принадлежащих к типам Proteobacteria и Spirochaetes, и к более низкой доле, относящейся к менее многочисленным типам (рисунок).Однако в целом отклонение в доле OTU было менее сильным для образцов, сохраненных в «NAP / замороженных», по сравнению с другими видами обработки, исследованными в этом исследовании. Единственной другой консервативной обработкой, которая была сопоставима с «NAP / замороженный», была консервационная обработка «РНК позже ® / замороженная». Доля OTU из доминирующего типа Firmicutes, однако, отклонялась значительно больше, чем при обработке «NAP / замороженный» по сравнению с контролем ( OR = 0,924 по сравнению с OR = 1.013 для NAP / замороженный; Рисунок), а отклонение относительно контроля для Proteobacteria, Spirochaetes и других менее многочисленных типов было намного сильнее (Рисунок). Что касается обработок, при которых замораживание не применялось, сохранение, для которого отклонение в доле OTU, принадлежащих к типу, было наименее сильным по сравнению с контролем, было «NAP / не заморожено» со значениями OR в диапазоне от 0,84 до 1,20 (a намного более узкий диапазон, чем у всех других незамороженных обработок, рисунок).

Таблица 1

Десять наиболее распространенных бактериальных типов микробиома кишечника овцы .

заморожено 16 03 ± 0,03 ,90 ± 0,03 0,03 acter 11 9118 35,77 ± 0,04 ± 0,03 0,02
мазки для судебно-медицинской экспертизы NAP Защита ДНК / РНК РНК позже ®
Замороженный Незамороженный Замороженный Незамороженный Замороженный Не замороженный
54,93 ± 0,02 50,08 ± 0,03 54,43 ± 0,03 56,92 ± 0,02 54,06 ± 0,02 52,20 ± 0,03 54,15 ± 0,03
35,93 ± 0,05 33,74 ± 0,04 29,99 ± 0,04 30,59 ± 0,04 36,34 ± 0,05 33,35 ± 0,04
Verrucom1118icrobia.03 2,22 ± 0,02 3,97 ± 0,04 3,25 ± 0,03 3,45 ± 0,03 3,64 ± 0,04 3,79 ± 0,03 2,72 ± 0,02
1 1811 ± 0,02
9111 3,36 ± 0,04 2,58 ± 0,03 2,80 ± 0,03 2,69 ± 0,03 2,56 ± 0,03 2,96 ± 0,03
Спирохеты 0,32 ± 0,01 1,202 2,13 ± 0,04 1,88 ± 0,03 2,71 ± 0,05 4,40 ± 0,09 1,30 ± 0,02 2,34 ± 0,04
Планктомицеты 0,68 ± 0,01 9111 0,68 ± 0,04 0,05 0,59 ± 0,04 0,71 ± 0,05 0,78 ± 0,05 0,71 ± 0,05 0,54 ± 0,04
Цианобактерии 0,52 ± 0,01 0,77 ± 0,01.42 ± 0,01 0,50 ± 0,01 0,53 ± 0,01 0,52 ± 0,01 0,37 ± 0,00 0,72 ± 0,01
Tenericutes 0,31 ± 0,00 0,60 ± 0,011 9111 0,00 ± 0,01 0,37 ± 0,00 0,40 ± 0,00 0,52 ± 0,00 0,29 ± 0,00 0,47 ± 0,00
Lentisphaerae 0,51 ± 0,01 0,61 ± 0,01 0,2011 0,00 911.24 ± 0,00 0,19 ± 0,00 0,25 ± 0,01 0,25 ± 0,01 0,43 ± 0,01
Фибробактерии 0,29 ± 0,02 0,13 ± 0,01 917 ± 11 0,02 0,18 ± 0,01 0,17 ± 0,01 0,15 ± 0,01 0,25 ± 0,02

Оценки параметров (точки), 95% доверительные интервалы (тонкие линии) и стандартное отклонение (толстые линии) от GAMM, моделирующих влияние консервативной обработки на долю ОТЕ, принадлежащих к бактериальным типам Firmicutes, Bacteroidetes, Verrucomicrobia, Proteobacteria, Spirochaetes и оставшимся менее многочисленным типам .Перехват был контрольной обработкой (немедленное замораживание судебно-медицинской экспертизы) образцов. Пунктирная линия представляет собой точку пересечения, а оценка параметра консервативной обработки с 95% доверительными интервалами, которые не перекрывают эту пунктирную линию, представляет собой значительное отклонение от контрольной обработки. Переменная ответа и объясняющая переменная «количество последовательностей» были масштабированы, что позволило провести относительное сравнение эффекта буферов сохранения между показателями альфа-разнообразия (но это означает, что абсолютные значения точки пересечения и количества последовательностей здесь не представлены).Числа над оценками параметров представляют собой отношения шансов, которые представляют отклонение доли OTU, принадлежащих к типу в рамках консервативной обработки, по сравнению с контрольной обработкой (судебно-медицинские мазки / замороженные).

Таблица 2

Выбор модели GLMM пропорции ОТЕ из филы Firmicutes (A), Bacteroidetes (B), Verrucomicrobia (C), Proteobacteria (D), Spirochaetes (E) и других менее распространенных типов ( F) по консервационной обработке; показаны количество параметров (K), логарифм правдоподобия (logLik), AICc моделей, изменение AICc по сравнению с моделью с лучшим рейтингом (ΔAICc) и веса модели Акаике (ω) .

ФИРМЫ 7 532 570 570 570 8109 570 8119
8217
TE 9101 9101 9101 9101 9101 9101 9101 506 контроль глубины последовательности, контроль глубины отбор выявил сильную поддержку эффекта консервативной обработки на все три показателя альфа-разнообразия (Таблица: а. Наблюдаемые OTU: ΔAICc = 8,13, AICc ω = 0,983, б. Разнообразие Шеннона: ΔAICc = 17.05, AICc ω = 0,999, c. PD: ΔAICc = 7,47, AICc ω = 0,977).

Таблица 3

Выбор модели GAMM для (A) наблюдаемых OTU, (B) разнообразия Шеннона и (C) филогенетического разнообразия (PD) в соответствии с глубиной секвенирования (более гладкий термин) и режимом сохранения; показаны количество параметров (k), логарифм правдоподобия (logLik), AICc моделей, изменение AICc по сравнению с моделью с лучшим рейтингом (ΔAICc) и веса модели Акаике (ω) .

Ранг модели Консервационная обработка K logLik AICc ΔAICc
1 + 9 −7969,479 15958,69 0 1
2 .249 21680,61 5721,92 <0,001
(B) БАКТЕРОИДЕТЫ
1 +

-617670 2 −11369.165 22742,33 8819,49 <0,001
(C) VERRUCOMICROBIA
1662 6985.054 0 1
2 2 −4702.280 9408.669 2423.61
+ 9 −2667.006 5353.742 0 1
2 2 −3707.030 7418.168.43 <0,001
(E) SPIROCHAETES
1 + 9 −2170,888 4361.507 16 1 −6081,280 12166,67 7805,16 <0,001
(F) ДРУГОЕ МЕНЬШЕ ОБОИХ PHYLA
1 + 3007.011 0 1
2 2 −1783.630 3571.261 564.249 <0.00163 <0,00163
70 9117 9117 0 −133,280 911
Ранг модели Последовательности Консервационная обработка K logLik AICc

76 96610 96610 966 966 966 966 966 966 966 966 966
(A) НАБЛЮДАЕМЫЕ ОТЕ
1 + + 19 −13.783 73,651 0 0,983
2 + 12 −27,344 81,777 8,13 81,777 8,13

288,697 215,05 <0,001
4 + 17 −125,742 291,858 218.21 <0,001
(B) РАЗНООБРАЗИЕ ШЕННОНА
1 + + 19 −102,407 250.900 250.900 + 17 −113,052 266,478 15,58 <0,001
3 + 12 −12013,4948 17,05 <0,001
4 10 -130,845 283,826 32,93 <0,001

ET 910EN9 9106E

+ + 19 −6,327 58,739 0 0,977
2 + 12 −19.558 66.206 7,47 0,023
3 10 -120,148 262,432 203,6910 262,432 203,6910 -112,520 265,414 206,68 <0,001

Все показатели альфа-разнообразия для каждой консервативной обработки (рисунок) были ниже, чем альфа-разнообразие контрольной обработки (точка пересечения на рисунке).Только для разнообразия Шеннона «мазки для судебно-медицинской экспертизы / незамороженные» и «ДНК / РНК-щит ™ / замороженные» 95% доверительный интервал оценки перекрывается с нулем (рисунок). Отрицательный эффект консервативных обработок на альфа-разнообразие по сравнению с «судебно-медицинскими мазками / замороженными» был сильнее для «ДНК / РНК Shield ™ / не замороженный», чем для всех других консервативных обработок (рисунок). Последнее предполагает, что бактерии в «ДНК / РНК Shield ™ / незамороженные» плохо сохранялись по сравнению со всеми другими методами консервирования. Однако для всех остальных методов консервирования альфа-разнообразие было очень схожим (рисунок).

Оценки параметров (точки), 95% доверительные интервалы (тонкие линии) и стандартное отклонение (толстые линии) от GAMM, моделирующих влияние консервативной обработки на наблюдаемые OTU, PD и контроль разнообразия Шеннона для глубины секвенирования . Перехватом была контрольная обработка (мазки для судебной экспертизы / замораживание) образцов. Пунктирная линия представляет собой точку пересечения, а оценка параметра консервативной обработки с 95% доверительными интервалами, которые не перекрывают эту пунктирную линию, представляет собой значительное отклонение от контрольной обработки.Переменная ответа и объясняющая переменная «количество последовательностей» были масштабированы, что позволило провести относительное сравнение эффекта буферов сохранения между показателями альфа-разнообразия (но это означает, что абсолютные значения точки пересечения и количества последовательностей здесь не представлены). Числа над оценками параметров представляют собой отношения шансов, которые представляют отклонение в альфа-разнообразии в рамках консервативной обработки по сравнению с контрольной обработкой (судебно-медицинские мазки / замороженные).

Вариации микробиома внутри и между индивидуумами

Когда мы тестировали на индивидуальную согласованность между обработками консервацией на основе дубликатов отдельных R (рисунок), результаты показали, что образцы сгруппированы в соответствии с консервационной обработкой (таблица: ΔAICc = 22.06, AICc ω = 1). Однако при исследовании вариаций микробиома на основе взвешенного показателя UniFrac, включающего всех особей овец, выбор модели выявил более сильную поддержку эффекта идентичности овец, чем консервативной обработки (рисунок, таблица). Действительно, большая часть вариации объяснялась идентичностью овец (таблица: ΔAICc = 189,10; R 2 = 0,77), за которой следовала консервативная обработка (таблица: ΔAICc = 43,89; R 2 = 0,10). Тот же анализ, основанный на невзвешенной метрике UniFrac, показал, что особи овец по-прежнему объясняют большую часть вариации (ΔAICc = 21.59; R 2 = 0,32; Дополнительная таблица 3). Интересно, что эффект консервативной обработки получил мало поддержки (дополнительная таблица 3; ΔAICc = -9,03; R 2 = 0,06), что свидетельствует о слабом влиянии консервирующей обработки на отсутствие / присутствие ОТЕ.

Анализ основных координат (PCoA) образцов овец особи R в соответствии с консервационной обработкой на основе взвешенной метрики UniFrac . Ось X и ось Y вместе объясняют 58.1% от общей вариации. Большая часть изменений объяснялась консервативной обработкой (ΔAICc = 22,06, AICc ω = 1).

Таблица 4

Выбор моделей PERMANOVA на основе взвешенной метрики UniFrac в соответствии с идентичностью овец и обработкой консервации; показаны количество параметров (k), логарифм правдоподобия (logLik), AICc моделей, изменение AICc по сравнению с моделью с лучшим рейтингом (ΔAICc) и веса модели Акаике (ω) .

0 9117 911 911 9114 911 9111 9117 9
Рейтинг модели Идентификация овец Консервационная обработка K logLik AICc 10 96610 96610 96610 966 96610 96610 966
(A) НАБОР ДАННЫХ С ИНДИВИДУАЛЬНЫМ R ТОЛЬКО
1 + 8 81.882 −143,263 0 1
2 2 62.762 −121.208 С 22.06 INDUS
1 + + 19 191.610 −337.135 0 1
2 + 6 −293,244 43,89 <0,001
3 2 76,07298 −148,038 18 82,955 −146,180 190,96 <0,001

Анализ основных координат (PCoA) выборок всех особей овец в соответствии с консервационной обработкой на основе взвешенного показателя UniFrac .Ось X и ось Y вместе объясняют 70,8% общей вариации. Большая часть вариации была объяснена отдельной овцой (ΔAICc = 189,10; R 2 = 0,77) с последующей консервативной обработкой (ΔAICc = 43,89; R 2 = 0,10).

Обсуждение

В этом исследовании мы оценили влияние различных методов консервирования на состав бактериального сообщества кишечника овец, альфа- и бета-разнообразие, а также стабильность в рамках лечения.Тампоны использовались для отбора проб фекалий и были высушены на воздухе (в случае судебно-медицинских мазков) или хранились в самодельном NAP-буфере, DNA / RNA Shield ™ или RNA позже ®, и либо немедленно замораживались, либо хранились в при комнатной температуре в течение 10 дней после отбора проб до выделения ДНК. Цель заключалась в том, чтобы сделать вывод о пригодности этих методов консервирования для полевых исследований, в которых замораживание или немедленная транспортировка в лабораторию для высокопроизводительного секвенирования невозможны. Мы обнаружили, что при наличии оборудования для замораживания мазки для судебно-медицинской экспертизы оставались лучшим методом сохранения.Однако, когда последнее невозможно, сохранение образцов в самодельном буфере NAP дает в целом наилучшие результаты.

Консервационные обработки повлияли на выход ДНК и глубину секвенирования, но последние не повлияли на результаты наших статистических тестов, поскольку мы учли глубину секвенирования в наших моделях. Образцы с более низким выходом ДНК привели к более высокой глубине секвенирования, что, безусловно, связано с тем, что точность измерения ДНК ниже, когда выход ДНК низкий, что приводит к недооценке истинного выхода при нормализации образцов для секвенирования.Наши данные не позволяют нам различить, связаны ли различия в выходе ДНК с методами экстракции, связанными с буфером, или с самим буфером. Однако центрифугирование во время экстракции для РНК , затем ® и буфер NAP неизбежны, поскольку клетки имеют одинаковую плотность для этих реагентов. Следовательно, любой, кто использует эти реагенты, будет обязан следовать этим шагам, поэтому мы твердо уверены, что в данном случае неважно, связаны ли различия с разными методами экстракции или буфером.Выход экстракции был ниже для всех обработок, которые не были заморожены, за исключением «ДНК / РНК Shield ™ / замороженный», что позволяет предположить, что последний буфер лучше всего сохранял целостность ДНК, когда образцы хранились при комнатной температуре.

Измерения альфа-разнообразия, полученные из «судебно-медицинских мазков / незамороженных», были очень похожи на образцы, хранящиеся в «ДНК / РНК Shield ™ / замороженные», что делает оба наименее разными по сравнению с контрольной обработкой. Однако пропорции OTU, принадлежащих к бактериальному типу, сильно отклонялись от контрольной обработки, показывая важность замораживания во время хранения образцов судебно-медицинских мазков.Наши результаты, основанные на невзвешенной матрице UniFrac, показывают, что сушка на воздухе образцов мазков для судебно-медицинской экспертизы в течение коротких периодов времени (10 дней в данном исследовании) перед замораживанием или выделением генетического материала допустима для исследований, которые сосредоточены только на наличии / отсутствии таксоны бактерий, но не их относительное количество. Однако следует избегать более длительных периодов сушки, поскольку различия в характеристиках образцов и климатических условиях в местах отбора образцов могут привести к более резким изменениям бактериального сообщества (Menke et al., 2015).

Мы подтвердили, что независимо от того, были ли образцы заморожены или нет, затронуты микробные сообщества, например, доля OTU, принадлежащих к бактериальному типу, что также было показано в других исследованиях (Bahl et al., 2012; Flores et al., 2015 ). Это контрастирует с исследованиями, в которых не было обнаружено различий в отношении обработки замораживанием, что могло быть связано с тем, что наши незамороженные образцы хранились при комнатной температуре в течение более длительного периода времени (10 дней), чем образцы этих исследований (24 часа– 3 дня; Dominianni et al., 2014; Теджо и др., 2015). Поэтому по возможности следует применять замораживание независимо от консервационной обработки. Кроме того, все методы консервации имели более низкое альфа-диверсификацию по сравнению с замороженными мазками для судебно-медицинской экспертизы. Таким образом, для полевых работ рекомендуется использовать мазки для судебно-медицинской экспертизы, если на полевом участке возможно замораживание после короткого периода сушки.

Все консервативные обработки с использованием коммерческого буфера (ДНК / РНК Shield ™ и РНК позже ®) оказали сильное влияние на долю OTU, принадлежащих к типу.DNA / RNA Shield ™ работал хуже, чем RNA позже ®, как когда образцы были заморожены, так и не заморожены, а альфа-различия для «DNA / RNA Shield ™ / не заморожены» были намного ниже по сравнению со всеми другими методами консервирования. Это может быть связано с отсутствием очень низкого обилия бактериальных OTU в образцах «ДНК / РНК Shield ™ / незамороженные» по сравнению с контролем, поскольку не наблюдалось чрезмерного роста конкретных бактериальных таксонов (дополнительные данные 3). Однако удивительно, что NAP показал лучшие результаты, чем все другие виды лечения, особенно при замораживании, поскольку три наиболее распространенных типа (Firmicutes, Bacteroidetes и Verrucomicrobia) имели почти равные доли ОТЕ по сравнению с контрольным лечением.Кроме того, альфа-разнообразие образцов, сохраненных в буфере NAP, было сопоставимо с другими видами обработки, независимо от замораживания. Эти результаты являются многообещающими, поскольку они подтверждают, что самодельный буфер NAP (Camacho-Sanchez et al., 2013) является дешевой альтернативой дорогой RNA later ® и DNA / RNA Shield ™, особенно когда морозильники не доступны. имеется в наличии. Хотя рецепт буфера NAP прост, качество хранения зависит от точности человека, готовящего его в лаборатории.Это могло привести к потенциальной систематической ошибке, если образцы в рамках проекта хранились в самодельных буферах, подготовленных разными людьми. Тем не менее, этот тип ошибки можно легко устранить, если исследователи знают об этой проблеме.

В целом, на разнообразие Шеннона наблюдалось более сильное влияние консервативной обработки, чем на наблюдаемые OTU и PD, а также на взвешенную, чем на невзвешенную метрику UniFrac. Это было связано с тем, что консервативная обработка оказывала более сильное влияние на относительную численность, чем на отсутствие / присутствие таксонов (что продемонстрировано влиянием консервационной обработки на долю OTU, принадлежащих к типу, а также на взвешенные и невзвешенные Метрика UniFrac).Таким образом, следует проявлять осторожность при сравнении значений различных методов сохранения (Tedjo et al., 2015), особенно когда эти значения основаны на показателях, включающих относительную численность таксонов, таких как индекс Шеннона. С положительной стороны, несмотря на эффект консервирующей обработки, большая часть вариаций микробиомов овец объяснялась индивидуумом, как было показано в других исследованиях (Dominianni et al., 2014; Hale et al., 2015; Song et al., 2016). ), что свидетельствует о сильной последовательности отбора проб в рамках применяемого метода.Кроме того, когда исследование интересовали только данные о присутствии / отсутствии, эффект консервативной обработки был еще ниже. Таким образом, можно проводить полезные сравнения, даже если оборудование для замораживания недоступно, при условии, что один и тот же метод сохранения применяется ко всем образцам в рамках исследования.

Заключение

При отсутствии каких-либо логистических ограничений немедленное замораживание мазка для судебно-медицинской экспертизы без буфера является предпочтительной консервативной обработкой. В ситуациях, когда требуется буфер для сохранения, наши результаты подтверждают сохраняющую способность коммерческих буферов для исследований микробиома кишечника, но также показывают, что самодельный буфер NAP дает превосходные результаты.Эффективность буфера NAP в стабилизации бактериальных сообществ в фекальных массах, собранных мазками, работает лучше, чем коммерчески доступные среды для консервации, даже когда замораживание недоступно, что делает эту недорогую самодельную консервирующую среду хорошей альтернативой для низкобюджетных исследований микробиома дикой природы в отдаленных районах области. Более того, тот факт, что NAP не считается «опасным грузом», делает эту консервирующую среду ценной в ситуациях, когда образцы должны быть отправлены по всему миру.

Вклад авторов

Задумал и разработал проект: MG, SS и KW.Проведены эксперименты: MG, KW. Биоинформатика и статистика: МГ, СМ. Написание рукописи: MG, SM, SS, KW.

Финансирование

Финансовая поддержка была предоставлена ​​грантами DFG SM (DFG SO 428 / 10-1), а также MG (DFG Gi 1065 / 2-1).

Заявление о конфликте интересов

Авторы заявляют, что исследование проводилось в отсутствие каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могут быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Нурай Атасой за техническую помощь и 11 овец за участие в этом исследовании.

Ссылки

  • Алтани А. А., Марей Х. Э., Хамди В. С., Насралла Г. К., Эль Зовалати М. Э., Аль Ходор С. и др. . (2016). Микробиом человека и его связь со здоровьем и болезнями. J. Cell. Physiol. 231, 1688–1694. 10.1002 / jcp.25284 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Афанасио К. Г., Чипман Дж. К., Виант М. Р., Мирбахаи Л. (2016). Оптимизация выделения ДНК рачка Дафния . PeerJ 4: e2004. 10.7717 / peerj.2004 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Bahl M.И., Бергстрём А., Лихт Т. Р. (2012). Замораживание образцов фекалий перед экстракцией ДНК влияет на соотношение Firmicutes и Bacteroidetes, определенное последующим количественным анализом ПЦР. FEMS Microbiol. Lett. 329, 193–197. 10.1111 / j.1574-6968.2012.02523.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Bahrndorff S., Alemu T., Alemneh T., Lund Nielsen J. (2016). Микробиом животных: значение для биологии сохранения. Int. J. Genomics 2016: e5304028. 10.1155 / 2016/5304028 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Bates D., Мехлер М., Болкер Б., Уокер С. (2015). Подгонка линейных моделей со смешанными эффектами с использованием lme4. J. Stat. Софтв. 67, 1–48. 10.18637 / jss.v067.i01 [CrossRef] [Google Scholar]
  • Бернем К. П., Андерсон Д. Р., Бернем К. П. (2002). Выбор модели и многомодельный вывод: практический теоретико-информационный подход. Нью-Йорк, штат Нью-Йорк: Спрингер. [Google Scholar]
  • Камачо-Санчес М., Буррако П., Гомес-Местре И., Леонард Дж. А. (2013). Сохранение РНК и ДНК из образцов млекопитающих в полевых условиях.Мол. Ecol. Ресурс. 13, 663–673. 10.1111 / 1755-0998.12108 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Caporaso J. G., Kuczynski J., Stombaugh J., Bittinger K., Bushman F. D., Costello E. K., et al. . (2010). QIIME позволяет анализировать данные секвенирования сообщества с высокой пропускной способностью. Nat. Методы 7, 335–336. 10.1038 / nmeth.f.303 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Капорасо Дж. Г., Лаубер К. Л., Уолтерс В. А., Берг-Лайонс Д., Лозупоне С. А., Тернбо П. Дж. И др. . (2011).Глобальные паттерны разнообразия 16S рРНК на глубине миллионов последовательностей на образец. Proc. Natl. Акад. Sci. США. 108 (Приложение 1), 4516–4522. 10.1073 / pnas.1000080107 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Чо И., Блазер М. Дж. (2012). Микробиом человека: на стыке здоровья и болезни. Nat. Преподобный Жене. 13, 260–270. 10.1038 / nrg3182 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Чу Дж. М., Леонг Л. Э., Роджерс Г. Б. (2015). Условия хранения образцов существенно влияют на профили фекального микробиома.Sci. Rep. 5: 16350. 10.1038 / srep16350 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • ДеСантис Т. З., Хугенгольц П., Ларсен Н., Рохас М., Броди Е. Л., Келлер К. и др. . (2006). Greengenes, проверенная химерами база данных генов 16S рРНК и рабочая среда, совместимая с ARB. Прил. Environ. Microbiol. 72, 5069–5072. 10.1128 / AEM.03006-05 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Доминианни К., Ву Дж., Хейс Р. Б., Ан Дж. (2014). Сравнение методов сбора биопробы фекального микробиома.BMC Microbiol. 14: 1. 10.1186 / 1471-2180-14-103 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Эдгар Р. К. (2010). Поиск и кластеризация на порядки быстрее, чем BLAST. Биоинформатика 26, 2460–2461. 10.1093 / bioinformatics / btq461 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Эдгар Р. К., Хаас Б. Дж., Клементе Дж. К., Айва К., Найт Р. (2011). UCHIME улучшает чувствительность и скорость обнаружения химер. Биоинформатика 27, 2194–2200. 10.1093 / bioinformatics / btr381 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Faith D.П., Бейкер А. М. (2007). Филогенетическое разнообразие (PD) и сохранение биоразнообразия: некоторые проблемы биоинформатики. Evol. Биоинформа онлайн 2, 121–128. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
  • Флорес Р., Ши Дж., Ю Г., Ма Б., Равель Дж., Гёдерт Дж. Дж. И др. . (2015). Среда для сбора и эффекты замедленного замораживания на микробный состав человеческого стула. Микробиом 3:33. 10.1186 / s40168-015-0092-7 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Fouhy F., Deane J., Ри М. К., О’Салливан Э., Росс Р. П., О’Каллаган Г. и др. . (2015). Воздействие замораживания на фекальную микробиоту, определенное с помощью секвенирования MiSeq и исследований на основе культур. PLoS ONE 10: e0119355. 10.1371 / journal.pone.0119355 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Guo Y., Li S.-H., Kuang Y.-S., He J.-R., Lu J.-H., Luo B.-J. и др. . (2016). Влияние кратковременного хранения при комнатной температуре на микробное сообщество в образцах кала младенцев. Sci. Rep. 6: 26648.10.1038 / srep26648 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Хейл В. Л., Тан К. Л., Найт Р., Амато К. Р. (2015). Влияние метода консервации на фекальную микробиоту обезьяны-паука ( Ateles geoffroyi ) в течение 8 недель. J. Microbiol. Методы 113, 16–26. 10.1016 / j.mimet.2015.03.021 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Джонсон Дж. Б., Омланд К. С. (2004). Выбор модели в экологии и эволюции. Trends Ecol. Evol. 19, 101–108. 10.1016 / j.tree.2003.10.013 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Кау А.Л., Ахерн П. П., Гриффин Н. В., Гудман А. Л., Гордон Дж. И. (2011). Питание человека, микробиом кишечника и иммунная система. Природа 474, 327–336. 10.1038 / nature10213 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Life Technologies (2011). Коллекция тканей RNAlater®: протокол раствора для стабилизации РНК. Доступно в Интернете по адресу: http://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/cms_056069.pdf (по состоянию на 19 января 2017 г.).
  • Лозупоне К., Найт Р. (2005). UniFrac: новый филогенетический метод сравнения микробных сообществ.Прил. Environ. Microbiol. 71, 8228–8235. 10.1128 / AEM.71.12.8228-8235.2005 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Lozupone C., Lladser M. E., Knights D., Stombaugh J., Knight R. (2011). UniFrac: эффективный показатель расстояния для сравнения микробного сообщества. ISME J. 5, 169–172. 10.1038 / ismej.2010.133 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Мартин М. (2011). Cutadapt удаляет последовательности адаптеров из операций чтения с высокой пропускной способностью. EMBnet.J. 17, 10–12. 10.14806 / ej.17.1.200 [CrossRef] [Google Scholar]
  • Мак-Мерди П. Дж., Холмс С. (2013). Пакет «Филозек». Доступно в Интернете по адресу: http://bioconductor.fhcrc.org/packages/2.13/bioc/manuals/phyloseq/man/phyloseq.pdf (по состоянию на 26 ноября 2013 г.).
  • Менке С., Мейер М., Соммер С. (2015). Изменения микробиома кишечника, наблюдаемые в образцах фекалий диких животных, подвергшихся воздействию естественных погодных условий: уроки анализа временных рядов с использованием секвенирования следующего поколения для применения в полевых исследованиях.Методы экол. Evol. 6, 1080–1087. 10.1111 / 2041-210X.12394 [CrossRef] [Google Scholar]
  • Накагава С., Катхилл И. С. (2007). Размер эффекта, доверительный интервал и статистическая значимость: практическое руководство для биологов. Биол. Ред. 82, 591–605. 10.1111 / j.1469-185X.2007.00027.x [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Нечватал Дж. М., Рам Дж. Л., Бассон М. Д., Нампрачан П., Ниц С. Р., Бадша К. З. и др. . (2008). Сбор фекалий, сохранение в окружающей среде и выделение ДНК для ПЦР-амплификации бактериальных и человеческих маркеров из человеческих фекалий.J. Microbiol. Методы 72, 124–132. 10.1016 / j.mimet.2007.11.007 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • О’Догерти К. К., Вирани А., Уилкокс Э. С. (2016). Микробиом человека и общественное здоровье: СОЦИАЛЬНЫЕ и этические соображения. Являюсь. J. Общественное здравоохранение 106, 414–420. 10.2105 / AJPH.2015.302989 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Оксанен Дж., Гийом Бланше Ф., Киндт Р., Лежандр П., Минчин П. Р., О’Хара Р. Б. и др. (2014). веганский: Пакет «Экология сообщества».Пакет R версии 2.2-0. Доступно в Интернете по адресу: http://CRAN.R-project.org/package=vegan
  • Пинейро Дж., Бейтс Д., Деброй С., Саркар Д., R. Core Team (2016). nlme: линейные и нелинейные модели смешанных эффектов. Пакет R версии 3, 1–128. Доступно в Интернете по адресу: http://CRAN.R-project.org/package=nlme
  • Quast C., Pruesse E., Yilmaz P., Gerken J., Schweer T., Yarza P., et al. . (2013). Проект базы данных генов рибосомных РНК SILVA: улучшенная обработка данных и веб-инструменты. Nucleic Acids Res.41, D590 – D596. 10.1093 / nar / gks1219 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Солтер С. Дж., Кокс М. Дж., Турек Э. М., Калус С. Т., Куксон В. О., Моффат М. Ф. и др. . (2014). Загрязнение реагентов и лабораторий может критически повлиять на анализ микробиома, основанный на последовательностях. BMC Biol. 12:87. 10.1186 / s12915-014-0087-z [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Соргель Д. А., Дей Н., Найт Р., Бреннер С. Э. (2012). Выбор праймеров для оптимальной таксономической классификации последовательностей гена 16S рРНК окружающей среды.ISME J. 6, 1440–1444. 10.1038 / ismej.2011.208 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Сонг С. Дж., Амир А., Меткалф Дж. Л., Амато К. Р., Сюй З. З., Хамфри Г. и др. . (2016). Методы консервации различаются по стабильности фекального микробиома, что влияет на пригодность для полевых исследований. mSystems 1, e00021 – e00016. 10.1128 / mSystems.00021-16 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Спеллерберг И. Ф., Федор П. Дж. (2003). Дань уважения Клоду Шеннону (1916–2001) и призыв к более строгому использованию видового богатства, видового разнообразия и индекса «Шеннона – Винера».Glob. Ecol. Биогеогр. 12, 177–179. 10.1046 / j.1466-822X.2003.00015.x [CrossRef] [Google Scholar]
  • Штумпф Р. М., Гомес А., Амато К. Р., Йоман К. Дж., Полк Дж. Д., Уилсон Б. А. и др. (2016). Микробиомы, метагеномика и сохранение приматов: новые стратегии, инструменты и приложения. Биол. Консерв. 199, 56–66. 10.1016 / j.biocon.2016.03.035 [CrossRef] [Google Scholar]
  • Теджо Д. И., Джонкерс Д. М. А. Э., Савелкул П. Х., Маскли А. А., ван Бест Н., Пиерик М. Дж. И др. . (2015).Влияние отбора и хранения образцов на состав фекальной микробиоты у здоровых и больных людей. PLoS ONE 10: e0126685. 10.1371 / journal.pone.0126685 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Ван К., Гаррити Г. М., Тидже Дж. М., Коул Дж. Р. (2007). Наивный байесовский классификатор для быстрого отнесения последовательностей рРНК к новой бактериальной таксономии. Прил. Environ. Microbiol. 73, 5261–5267. 10.1128 / AEM.00062-07 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Wood S.(2006). Обобщенные аддитивные модели: введение в R. Бока-Ратон, Флорида: Пресса CRC. [Google Scholar]
  • Wu G. D., Lewis J. D., Hoffmann C., Chen Y.-Y., Knight R., Bittinger K., et al. . (2010). Методы отбора проб и пиросеквенирования для характеристики бактериальных сообществ в кишечнике человека с использованием тегов последовательности 16S. BMC Microbiol. 10: 1. 10.1186 / 1471-2180-10-206 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
  • Зуур А., Иено Э. Н., Уокер Н., Савельев А. А., Смит Г. М.(2009). Модели смешанных эффектов и расширения в экологии с Р. Берлином: Springer. [Google Scholar]

Буфер и полировщик для ногтей — A Thrifty Mom

Буфер и полировщик для ногтей

Получите красивые, блестящие, естественно красивые ногти с электронным буфером для ногтей и полировщиком.

Электронная система ухода за ногтями Care me

Позаботьтесь о своих ногтях дома и получите естественные, полированные ногти без лака и красок.Полирует, сияет и полирует.

  • Электронный буфер для ногтей и полировщик — Работающий от 2 батареек AA (не входят в комплект), ролик вращает удивительные 30 оборотов в секунду (RPS), аккуратно подпиливая ногти до нужной формы, удаляя гребни, пятна, обесцвечивание и разглаживая поверхность ногтя, полирует ногти, чтобы восстановить блеск за считанные минуты. Сохраняйте естественность и сияние ногтей на пальцах рук и ног. Не бойтесь соревноваться с системой Amope Pedi Perfect Nail Care System.
  • Revitalizing Your Naked Shiny Nails — Придает на 300% больше блеска, чем голые ногти, обеспечивая глянцевый блеск на несколько дней.Наслаждайтесь чистыми, натуральными здоровыми ногтями без вредных химикатов. Вы не выглядите так, как будто вы пользуетесь лаком, но выглядите так, будто у вас идеальные ногти! Не беспокойтесь о том, что верхнее покрытие может отслаиваться, отслаиваться или стираться.
  • Лучшее соотношение цены и качества — Поставляется с 5 сменными насадками: 1 папка; 2 полировальные головки и 2 полировальные головки. Они проверены более толстыми и, следовательно, служат дольше, чем другие бренды.
  • Отличный инструмент для домашнего маникюра и педикюра — получите профессиональные результаты маникюра за небольшую плату за посещение маникюрного салона.Если вы предпочитаете натуральные светящиеся ногти вместо химического лака, этот продукт для вас!
  • Уход за ногтями прост — заботьтесь о ногтях быстро и без усилий.

вам также может понравиться:

5 X 2way Dotting Pen Инструмент для мраморизации + 15 шт. Кисть для дизайна ногтей + Набор из 10 инструментов для разметки ногтей Набор инструментов

Набор лака для ногтей Nail Art — 8 неоновых цветов (4 кисти для карандашей)

Nail Art Liquid — Сделайте идеальный маникюр легко!

лот из 10 полиролей

***********************

Вы можете воспользоваться БЕСПЛАТНОЙ доставкой с Prime и получить ее через два дня … помните, вы можете попробовать Prime БЕСПЛАТНО в течение 30 дней.

Попробуйте Prime БЕСПЛАТНО!

Ищете другие предложения в Интернете? Щелкните здесь, чтобы увидеть больше БЕРЕЖНЫХ ПРЕДЛОЖЕНИЙ. Обратите внимание, что цены Amazon часто меняются, поэтому цены могут быть выше или ниже без предварительного уведомления.

Предыдущая статьяЕженедельный обзор AmazonСледующая статьяДезодоратор для обуви

Как сделать буфер для лизиса RIPA

О буфере для лизиса RIPA

RIPA, что означает анализ радиоиммунопреципитации, буфер — это обычно используемый раствор для лизиса, используемый для лизиса клеток и тканей, предотвращая деградацию белка.Таким образом, буфер для лизиса RIPA используется для экстракции белков для их анализа, например, в экспериментах Вестерн-блоттинг или ELISA.

Буфер для лизиса

RIPA работает путем солюбилизации клеточных и ядерных мембран за счет действия агрессивных детергентов дезоксихолата натрия и SDS, а также более мягкого NP-40. Действие этих детергентов приводит к разрушению липидных мембран, а также к межбелковым взаимодействиям с высвобождением белков в раствор.

Не забывайте добавлять ингибиторы протеаз в буферный раствор для лизиса RIPA, чтобы предотвратить преждевременное переваривание протеинов какими-либо ферментами протеазы!

Скачать рецепт в формате PDF

Чтобы загрузить рецепт буфера для лизиса RIPA в формате PDF, щелкните здесь.

Рецепт лизисного буфера RIPA

Приведенный ниже рецепт можно использовать для приготовления 100 мл буферного раствора для лизиса RIPA. При необходимости масштабируйте объемы.

Как приготовить буферный раствор для лизиса RIPA

  1. Отмерьте 3 мл хлорида натрия (5 M), 5 мл Tris-HCl (1 M, pH 8,0), 1 мл nonidet P-40, 5 мл дезоксихолата натрия (10%), 1 мл SDS (10%) и добавить во флакон Duran на 100 мл.
  2. Долейте во флакон Duran 100 мл ddH 2 O.
  3. Смешайте реагенты, добавив магнитную блоху во флакон и поместив на магнитную мешалку.
  4. [Необязательно] Перед использованием буфера для лизиса RIPA добавьте в раствор желаемое количество ингибиторов протеазы (например, PMSF).

Хранение буфера для лизиса RIPA

Храните буферный раствор для лизиса RIPA в холодильнике (+2 o C — 8 o C) в течение относительно коротких периодов времени (несколько недель).

Иногда детергенты в буфере для лизиса RIPA могут повторно выпадать в осадок с течением времени. Если это произойдет, нагрейте раствор (37 o C) и перемешайте, чтобы растворить компоненты.

Для более длительных периодов хранения, аликвотируйте и храните лизисный буфер RIPA в морозильной камере (-20 o C). Разморозьте аликвоты при слабом нагревании (37 90 306 o 90 307 C) и снова смешайте компоненты с раствором. Не замораживайте повторно после размораживания.

Безопасность

Будьте осторожны при обращении с детергентами (nonidet P-40, дезоксихолат натрия и SDS) при приготовлении буфера для лизиса RIPA, так как они опасны.

Добавить комментарий

Ваш адрес email не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

*